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1、CytologicalStudymethods,细胞结构,细胞组分,细胞培养细胞工程,分子生物学和蛋白质研究,Chapter3Cytologicalstudymethods,Microscope显微镜specimen样品,样本confocal共焦的Fluorescence荧光Resolution分辨率,Keyterms,光学显微镜电子显微镜,显微镜,明视野,荧光,激光共聚焦,相差,透射电子显微镜TEM扫描电子显微镜SEM扫描隧道电子显微镜STM原子力显微镜,3.1Cellstucturestudymethod,佛观一滴水，八万四千虫,朴素的显微观点,1.构成：照明系统光学放大系统机械装置2.原
2、理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一,3.1.1光学显微镜,步放大成像。,光学显微镜的成像原理,使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大10倍，另一个能放大20倍，那么整个镜片组合的放大倍数就是1020=200倍。复合显微镜中通常有两级串联放大系统，一级为物镜，另一级为目镜。,3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61/NA其中为入射光线波长；NA为镜口率nsin/2n=介质折射率=镜口角（样品对物镜镜口的张角）思考：如何提高显微镜的分辨能力？,倒置显微镜,顺置显微镜,B暗视野显微镜聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进
3、人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。,C荧光显微镜（Fluorescencemicroscope）,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。显微镜荧光利用光源激发光化荧光,荧光显微镜,标记荧光,免疫荧光（光学免疫，电镜免疫）,免疫荧光,细胞的各种亚组分的标记活细胞和死细胞中特异的蛋白质特异的离子标记,荧光显微镜的应用,D相差显微镜,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种
4、结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1.环形光阑：位于光源与聚光器之间。2.相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4,激光扫描共焦显微镜,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。,LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)http:/www.itg.uiuc.edu/,Theconf
5、ocalscanningmicroscopeavoidsthelastproblembypermittingtheobservertovisualizefluorescentmoleculesinasingleplaneoffocus,therebycreatingavastlysharpercross-sectionalimage,荧光共振能量转移技术(FRET)检测活体种生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,可用于检测某一细胞中蛋白质分子是否存在相互作用。供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，距离在10纳米以内时，就会发生一种非放射性的能量转移现象，产生FRET现象。FR
6、ET反应了体内两种蛋白质是否直接相互作用及作用的强弱。,荧光漂白恢复技术（FRAP）利用高能量激光束照射使特定区域的荧光发生不可逆的淬灭。光漂白区荧光的恢复可以通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或者胞质种运动至光漂白区而实现。可以定性与定量地研究蛋白质的运动。,3.1.2电镜,电子光学系统由照明系统、标本室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成；真空系统是保持电镜的真空度；电子学系统即供电系统，需要高压稳压。,A透射电镜（TEM）,以电子束作光源，电子束的波长短，波长小于0.1nm电磁场作透镜，高电压工作。电镜镜筒为真空环境。图像用荧光屏显示或者感光胶片做记录。超薄样品（4050nm），利用重
7、金属盐对标本染色分辨力最佳可达0.2nm，实际分辨力容易受到制样技术的影响。放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构。,Specimenpreparation,B扫描电镜（SEM）,工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,Redbloodcell
8、,Yeast,Sperm,工作原理：用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。扫描电镜的特点：主要观察样品的表面形貌。样品采用CO2临界点干燥法，表面还需要喷镀一层金膜。景深大，获得的是清晰逼真的三维立体图像；分辨力不太高：310nm。不能用来观察活的生物样品，难以观察细胞的全貌。,C扫描隧道显微镜（STM）,原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流
9、强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,3.2细胞组分的分析方法,3.2.1细胞组分的分离3.2.2细胞组分的定性研究方法,3.2.3细胞组分的化学定量分析,Mostanimalandplanttissuescontainamixtureofcelltypes.However,aninvestigatoroftenwishestostudyapurepopulationofonetypeofcell.Insomecases,cel
10、lsdifferinsomephysicalpropertythatallowsdifferentcelltypestobeseparated.thusthesecellscanbeseparatedonthebasisofdensity.itisessentialtoisolatequantitiesofeachofthemajorsub-cellularorganellestostudytheirstructuresandmetabolicfunctionsindetail.,一离心方法,1.差速离心利用不同的离心速度产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。适合分离沉降速率
11、差别较大的亚微结构颗粒。多次离心达到纯化的目的,2.密度梯度离心,将需要分离的细胞组分小心铺放在含有密度逐渐增加，形成密度剃度，高溶解性的，惰性的溶液的表面，不同的样品由于其密度差异，在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动，形成不同的沉降带，从而实现分离的目的。差速离心与密度梯度离心结合可以达到精细分离的目的。,差速离心,密度剃度离心,二流式细胞术,用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：,包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选
12、出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计,3.2.2细胞组分的定性研究方法组织化学和细胞化学,利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合，通过显示剂在细胞中的定位以及颜色的深浅来进行某种物质的定性与定量分析。福尔根（Feulgen）反应显示DNAPAS反应显示多糖四氧化锇显示不饱和脂肪酸苏丹III显示磷脂和胆固醇米伦反应显示蛋白质的酪氨酸残基苏丹黑苏丹III格莫瑞（Gomori）反应显示碱性磷酸酶,二免疫细胞化学方特异蛋白的定位与定性,根据抗体能与对应的抗原自行识别结合的免疫学原理，来检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量,（一）光镜水平的免疫
13、细胞化学方法：1.免疫荧光技术：免疫学技术与普通荧光显微镜以及激光共焦点扫描显微镜相结合使用的一种方法。利用免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光束标记相结合用于研究特异蛋白在细胞内分布的方法。其方法快速，灵敏，但分辨率有限。2.免疫酶标技术：用酶（如辣根过氧化酶）代替荧光素与抗体耦联，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，可以在普通光学显微镜下观察。（二）电镜水平的免疫细胞化学方法免疫电镜技术：同样利用抗原抗体的原理，免疫电镜技术在超微结构水平研究特异蛋白的定性与定位，有效提高样品的分辨率。使用过程种的关键问题使既要保持样品蛋白的抗原性，又要尽量保持样品的精细结构。包含免疫铁蛋白技术，免疫酶标
14、技术，免疫胶体金技术。,三细胞内特异核酸序列的定位和定性,原位杂交：,对细胞内特异核酸（DNA或RNA）进行定位、定量分析通常采用原位杂交的方法。以目标核酸的互补序列为探针，对细胞或者组织标本进行杂交处理，确定特异核酸序列在细胞中或者染色体上位置的方法。既有光镜水平的原位杂交也有电镜水平的原位杂交。是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。,四电泳,SDS-PAGETwodimensionPAGE(2-DE),Isoelectricfocusingelectrophoresis,IFE用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度每种蛋白质都将迁移至与它
15、的pI相一致的pH处,具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的,Two-dimensionalelectrophoresis将IFE与SDS-PAGE结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开,BRadioactiveisotope,常用的一些放射性同位素：3H，14C，32P，35S，131I方法：同位素标记-固定-切片-涂胶-暴光,CDNArecombine,PCR
16、（聚合酶链式反应）DNAcloneDNAsequenceanalysis,D免疫印迹（westernblotting）,3.2.3定量细胞化学分析技术显微分光光度技术细胞流式仪,显微分光光度技术,细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。,细胞流式仪,原理：细胞群体分散后对待测的某种成分进行特异的荧光染色，然后悬液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，每秒25万个细胞的速度通过流式细胞仪。在激光束的照射下，这些细胞带上不同的电荷，并可根据电荷性质分选出高纯度的细胞亚群，
17、检测器记录每细胞中待测成分的含量。,方法：组织小块-酶消化-培养培养液：人工合成，血清术语：原代，传代，细胞系，贴壁，悬浮,3.3细胞培养细胞工程micromanipulation,细胞培养,（一）动物细胞培养,群体培养：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；克隆培养：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。转鼓培养法：为制取细胞产品而设计，大容量旋转培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。,原代培养：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养。细胞株：从原代培养细胞群中筛
18、选出的具有特定性质或标志的细胞群。细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。克隆：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,有限细胞系：当传代到50代以后不能再继续传下去的细胞系，因其传代次数有限，称为有限细胞系。永生细胞系：在持续传代培养过程中，部分细胞发生了遗传突变，并且使其带有癌细胞的特点，无限制地传代下去。根本特点是然色体明显改变，失去接触抑制。细胞克隆：利用单细胞克隆培养或者通过药物筛选的方法从某一细胞系中选择出来的单个细胞，并由此增殖形成具有基本相同遗传性状的的细胞群体称为细胞克隆。细胞株：经过生物学鉴定，具有特殊
19、的生物学性状或者标记的细胞克隆称为细胞株。不论是原代细胞还是传代细胞，一般不能保持体内原有的细胞形态只要存在成纤维样细胞，上皮样细胞以及少量的游走细胞。,（二）植物细胞培养,外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。,细胞工程细胞融合,细胞融合：通过培养和介导，两个或多个细胞合并成
20、一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交。同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。,细胞工程单克隆抗体,单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,单克隆抗
21、体,细胞工程显微操作,Micro-injectionTransgeneticanimalNucleustransport,Microinjection,3.4用于细胞生物学研究的模式生物,一、病毒：结构简单，基因组小，繁殖快，适合遗传操作。主要用于基因表达调控，生物大分子相互作用，生命物质自组装以及肿瘤的发生与防治方面。二、细菌：基因结构简单；大肠杆菌测序已经完成；培养方便，生长快；突变株的诱导，鉴定分离技术成熟；转基因技术成熟三、酵母：单细胞真核生物的代表；生长迅速而且易于遗传操作；不仅具有细菌的一些有点，而且具有真核细胞的组织结构；用于研究的主要有裂殖酵母和芽殖酵母。四、线虫：秀丽隐杆线虫
22、基因组测序已经完成；生命周期3天，繁殖快；显微镜下通体透明，共有959个细胞；细胞谱系清楚；五、果蝇：黑腹果蝇基因组测序完成，13601个基因；基因组进化保守，与人来同源性较高；具有丰富的生物学行为，易于遗传操作,六、斑马鱼：容易繁殖，孵化后3个月后性成熟，每次产卵200个；鱼卵产出一天就可完成早期胚胎发育，整个胚胎发育在体外进行；鱼卵和胚胎均是透明的便于观察；基因组大小与人来类似，许多基因与人类存在一一对应的关系。七、小鼠：小型哺乳动物，在进化上很接近人类；基因组测序完成，与人类非常相近；八、拟南芥：个体小，株高30厘米；生长周期6周左右；种子数量大，生活力强；自花授粉植物，基因高度纯合；基因测序已经完成，是具最小基因组的植物材料。,