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1、液相色谱的分离机理及色谱柱选HPLC参数时的基本考虑n溶解度 - 选择流动相的条件n分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用n样品的基质 - 考虑如何前处理n在基质中样品的含量 n检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光?n找出样品中不同组份之间的差异n摸索条件的重要线索极性问题液相色谱的分离机理n 正相n 反相n 体积排除n 离子交换n 其他n不同的分离模式是不同的机理吸附色谱的分离机理 随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短 吸附色谱概述n分离基于样品的极性差异。n洗脱次序 一般为正相，即：极性低的先被洗脱n常用的流动相n非极性有机溶剂，如己烷n乙酸等为添加剂n常用固定
2、相n硅胶、氧化铝等。分配色谱的分离机理分配色谱概述n反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离n洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱n常用的流动相：n有机溶剂如甲醇、乙腈，水n应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法n常用固定相：n碳十八、碳八、胺基等基团n反相色谱固定相多为键合相?键合相色谱柱n以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。n优点n固定相稳定，不易流失n应用广泛，可使用多种溶剂n消除硅羟基的不良影响n缺点npH值不能小于3n同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同体积排除色谱的分离机理凝胶色谱概述n 凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）n 分离基于分子
3、在溶液中的体积大小n 洗脱次序：大分子先被洗脱n 流动相不参与分离，只起溶剂作用n 分离效率低n 色谱行为容易预测GPC的校正 分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离液相色谱柱及分离机理的关系n从色谱方法上分n正相 / 反相n离子交换n分子体积排除n亲合n从柱子类型上分n分配 / 吸附n离子交换n凝胶n亲合液相色谱的方法开发（二）梯度方法梯度洗脱的特点n优点n单位时间的分离能力增加n检测灵敏度提高n缺点n仪器设备要求高n不适合某些检测方式n柱需再生n定量分析的重复性较低如不用梯度：分离不理想梯度条件的优化梯度曲线压力曲线检测器对检测器的要求n高灵敏度n可重现的设置n合适的带宽n快速或可变的时间
4、常数n宽的线性响应n容易使用及保养n自我诊断功能检测器的种类996电电化化学学示示差差折折光光电电化化学学脉脉冲冲安安培培荧荧光光电电导导固固定定波波长长紫紫外外光光电电二二极极管管矩矩阵阵可可调调波波长长紫紫外外/ /可可见见可可编编程程紫紫外外/ /可可见见其其他他放放射射性性、质质谱谱 热热能能、L LA AL LL LS S 蒸蒸发发质质量量、粘粘度度衡量检测器的指标n灵敏度 S = R / QnR是检测器响应值的增量nQ是样品量的增量n噪音 没有样品时检测器的最大输出信号n漂移 检测器在一段时间内响应值的变化n线性动态范围 最大线性相应与最小检出限之比n最小检测限 样品产生两或三倍于
5、噪音信号时的浓度n信噪比 S/Nn注意 最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此紫外-可见光检测器n基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号差n如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊)Beers Law - BEER定律n光能量n P0 = 透过溶剂的光能量n P = 透过样品的光能量n光通量(透过率%) T=P/P0n吸光度 A = -log(T)= log(P0/P)n吸光度 = 单位吸光度 流动池长度 溶液浓度n即 A = abc浓 度透过率 %*吸光度 AU*浓 度同紫外检测器灵敏度有关的因
6、素n信号强度(S)n从BEER定律可看出n样品的种类n样品浓度及进样的体积n检测池的长度n所使用的波长，检测器的时间常数n噪音(N)n流动相n所使用的波长，灯的能量n检测器的时间常数n非检测器因素 - 电噪音，泵脉动等噪音噪音10%1%1AU.25AUS/N = 1/0.1=10 S/N = 0.25/0.01 = 25紫外检测器的溶剂影响n不同种类溶剂有其截止波长n溶剂的质量好坏对其截止波长有影响n为何溶剂质量不好?n含紫外吸收的杂质n溶解在其中的氧气n缓冲液溶质的紫外吸收200 220 240 260 乙 腈甲 醇示差折光检测器nDifferential Refractive Index
7、Detector示差检测器的注意事项n不能做梯度实验n最大的池耐压是 100 psin流速范围是 0.3 - 10 ml/min. 液相色谱的定性及定量技术色谱峰定性n鉴别每个色谱峰n通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份n大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性n用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AU
8、MinutesUracilEthylparabenPropylparaben进一步的确认n标准加入n同时用其他方法n其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）n其他检测器nPDA，光谱图比较、谱库检索nMS，质谱图解析、谱库检索n其他仪器方法定量分析的具体内容n确定样品的类型，主要成分/痕量成分n使分析条件的分离度（R）大于：1.5n色谱峰的定性，峰一致性测定n检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围n用标样建立标准曲线n检查方法的准确度及精确度n用标样定期检查方法痕量分析n如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：n分析前浓缩样品n选择高灵敏度检测器n用衍生法n使色谱体系最优化n使用短的微
9、径柱（减少样品的稀释）n使用高效色谱柱n使k值尽可能小n增加进样体积和浓度n使用低流速（N增加）n采用梯度淋洗常用的定量方法n峰面积百分比法n由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用n外标法n在液相色谱中用的最多n内标法n准确，但是麻烦n在标准方法中用的最多外标法定量n配制一系列已知浓度的标样外标法定量（二）n实际色谱图0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u t
10、e s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s05010015020
11、025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()标准曲线外标法定量（三）n计算公式n特点n无需各组份都被检出、洗脱n需要标样n标样及样品测定的条件要一致n进样体积要准确iXiiiXARFCXRXCRFii样品响应值未知组分的浓度标样响应值标样浓度校正因子)()()()(内标法定量（一）n配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（二）n实际色谱图0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthy
12、lParabenPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050样品浓度标样峰面积内标样峰面积标准曲线内标法定量（三）n计算公式：n特点：n无需各组份都被检出、洗脱n需要标样，需要内标样n结果与进样体积无关.)()()()().(siiXiiiXAARFCXCXRSIRRFii内标峰面积样品峰面积未知组分的浓度标样浓度标样响应值内标样响应值校正因子内标法定量（四）n对内标物的要求n化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)n在样品中不存在n不与样品中组份发生任何化学反应n保留值与待测组分接近n浓度（响应值）与待测组分相当n其色谱峰与其他色谱峰
13、分离好峰面积百分比法定量n公式：n特点：n各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点n与进样量无关n不需标样n简单%100%iAiAC可接收的检测范围n校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误最低浓度标样最高浓度标样所希望的检测范围线性问题灵敏度问题检测器响应样品浓度定量校正曲线n曲线A：n因在零浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开n曲线B：n在此浓度内，检测器的响应值是非线性的n曲线C：n可接受的理想状态，实际情况应是 其延长线到零点n曲线D：n表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是样品制备时的损失AB
14、CD高效液相色谱仪的使用、保养 及注意事项色谱柱的使用及保养n流动相的转换n特别是GPC柱n流速(压力)的变化幅度n温度的变化幅度n专用色谱柱 样品及溶剂的要求色谱柱的清洗n对所做的样品要有充分的了解n用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗n硅胶柱的一般方法n先用甲醇洗去极性杂质n用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化n键合相柱(烷基)的一般方法n20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗色谱柱的存放n存放前的处理n除去杂质、盐 n合适的存放溶剂n避免色谱柱床的干枯n避免机械震动n防止细菌生长n注意存放的温度在线的保护装置n给色谱柱提供物理的保护n除去样品及流动相中的颗粒n给色谱柱提供
15、化学的保护n防止分析柱被化学污染n装置n在线过滤器n自装填料保护柱n预装保护柱 在线过滤器在线过滤器n防止颗粒在色谱柱头累积n优点：基本不影响柱效 保护柱保护柱n可避免化学污染。色谱泵的保养n流动相要过滤n常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用水冲洗柱塞杆清洗孔n拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为准n更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性如不互溶，要用一种中间溶剂过渡，要防止沉淀n进液处的砂芯过滤头要经常清洗；n避免泵内堵塞或有气泡；n每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；紫外灯的保养：n在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。流动相方面n除去微粒n
16、纯度的要求n超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低n缓冲液的pH值，在填料的允许范围内n缓冲液（盐）的浓度n溶剂：色谱纯，并与填料相匹配n溶剂中的杂质含量n流动相对样品的溶解度n有机溶剂或水的比例对流动相的要求:n除色谱柱对流动相对的要求外，还有n与检测器匹配n脱气n避免卤素离子（不锈钢系统）n溶剂的粘度n细菌的生长流动相及样品的预处理流动相的脱气n流动相脱气的目的n使色谱泵的输液准确n输液均匀准确，并且脉动减小n保留时间及色谱峰面积的重现性提高n提高检测的性能n防止气泡引起的尖峰n基线稳定，信噪比增加n溶剂的紫外吸收本底降低n保护色谱柱n减少死体积n防止填料的氧化流动相脱气的方法n加热n简单
17、，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化n抽真空n同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果n超声波n简单，但效果不理想。n通惰性气体（一般用氦气）n可保持连续脱气，多用于低压梯度n脱气机n可保持连续脱气，多用于低压梯度样品方面n除去微粒及杂质n了解样品在流动相中的溶解度n如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 n了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用样品的预处理n样品预处理的目的n除去微粒n减少干扰杂质n浓缩微量的组份n提高检测的灵敏度及选择性n改善分离的效果n有利于色谱柱及仪器的保护样品的预处理重要性n占样品分析时间的比例n样品预处理所用
18、时间远大于色谱分离的时间n占分析的消耗总成本最大n消耗大量的溶剂及其他化学品n实验的重复性及准确性最差的环节n影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤是决定性的步骤样品预处理常用的方法n高速离心n过滤、超滤n选择性沉淀n衍生反应n液-固萃取 / 液-液萃取n Sep-Pak样品处理小柱n其他去除微粒n过滤n过滤膜/过滤装置n有机(0.5m)/无机(0.45m)n膜片可更换n一次性使用的膜“Cartridge”n使用方便简单，交叉污染小n有更小内径，可用于微量样品的处理n高速离心n大于：10,000g进样的注意事项n手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再
19、转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：n1 专门的纯水机或超纯水机；n2 去离子水重蒸；n3 二次或三次重蒸水；n4 采用类似家用的纯水机；n5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；n6 其它途径；常用缓冲液及其pH值洗针溶剂的注意事项 洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：流动相洗针溶剂缓冲溶液，反相50% 水 50% 甲醇纯缓冲溶液100% 水非水溶液，反相100% 甲醇正相流动相GPC流动相离子交换对离子试剂的水溶液