《苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究-李小华.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究-李小华.pdf（57页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、分类号 学号 M201475299 学校代码 1 0 4 8 7 密级 硕士学位论文 苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究 学位申请人 ： 李小华 学科专业 ： 药物分析学 指导教师 ： 姜宏梁教授 答辩日期 ： 2016 年 5 月 _A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master A study on composition and hypolipidemic effect of total saponins from Kuding tea Candidate
2、 : Xiaohua Li Major : Pharmaceutical analysis Supervisor : Prof. Hongliang Jiang Huazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China May, 2016 _ 独创性声明 本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明
3、。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切 法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅 和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 _ 目 录 缩略词 . 1 摘
4、要 . 2 Abstract . 4 引 言 . 6 第一章 苦丁茶中皂苷类化合物的提取分离及结构鉴定 . 7 1 前言. 7 2 实验仪器及材料. 7 2.1实验仪器 . 7 2.2实验试剂 . 7 2.3实验材料 . 8 3 实验方法. 8 3.1苦丁茶皂苷提取物的制备 . 8 3.2苦丁茶皂苷的分离 . 8 4 实验结果与讨论. 9 5 本章小结. 12 第二章 基于 UPLC-MS/MS 的苦丁茶皂苷成分的全面表征 . 13 1 前言. 13 2 实验仪器与材料. 13 2.1实验仪器 . 13 2.2实验材料 . 13 3 实验方法. 13 3.1 样品制备 . 14 3.2 色谱条
5、件 . 14 3.3质谱条件 . 14 4 实验结果与讨论. 14 5 本章小结. 16 第三章 苦丁茶皂苷的降血脂作用及机理研究 . 22 1 前言. 22 2 实验仪器与材料. 22 _ 2.1实验仪器 . 22 2.2实验试剂 . 23 2.3实验动物 . 23 3 实验方法. 23 3.1苦丁茶提取物的制备 . 23 3.2动物造模及给药 . 23 3.3小鼠血清生化指标的检测 . 23 3.4组织形态学观察 . 25 3.5总 RNA 制备 . 25 3.6小鼠肝脏总 RNA的纯度的检测 . 26 3.7 小鼠肝脏 CDNA 的合成. 26 3.8 引物的设计与合成 . 26 3.9
6、实时定量 RT-PCR 基因表达 . 27 4 结果与讨论. 28 4.1苦丁茶皂苷对高脂血症小鼠生化指标的干预作用 . 28 4.2苦丁茶皂苷提取物干预后高脂血症小鼠肝脏组织的形态学分析 . 29 4.3 苦丁茶皂苷提取物对高脂血症小鼠降血脂相关基因表达的干预作用30 4.3.1 苦丁茶皂苷干预高脂血症小鼠肝脏 HMG-COA基因表达的影响 . 30 4.3.2苦丁茶皂苷干预高脂血症小鼠肝脏 LDL-R基因表达的影响 . 30 4.3.3苦丁茶皂苷干预高脂血症小鼠肝脏清道夫受体基因表达的影响 . 30 5 本章小结. 31 总 结.33 综 述 . 34 参考文献 . 38 致 谢 . 48
7、 附录：苦丁茶中分离得到的化合物核磁图谱 . 49 _ _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 缩略词 缩略词 英文全称 中文全称 UPLC Ultra-high performance liquid chromatography coupled with MS/MS Tandem mass Spectrometry 超高效液质联用 QTOF Triple quadrupole linear ion trap 飞行时间质谱 TC Total cholesterol 总胆固醇 TG Triglyceride 甘油三酯 HDL High denistyi liportien 高密度
8、脂蛋白 LDL Low denistyi liportien 高密度脂蛋白 HDL-C High-density lipoprotein cholesterol 高密度脂蛋白-胆固醇 LDL-C low-density lipoprotein cholesterol 低密度脂蛋白-胆固醇 AI Aeorsclerosis index 动脉粥样硬化指数 AS Ahteorcsleoriss 动脉粥样硬化 HFD Highaftdiet 高脂膳食 CD36 Cluster of differentration 36 36 分化抗原簇 SA Scavenger receptor 清道夫受体 SA-B
9、I Scavenger receptor class B type I B类清道夫受体 I SA-AI Scavenger receptor class A type I A类清道夫受体 I OxLDL oxidizedlowdensitylipoprotein 氧化型低密度脂蛋白 PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 LCAT Lecihtincholesteorlacyltransferase 卵磷脂胆固醇酞基转移酶 Hmgcr 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase 3-羟基 3-甲基戊 二酸单酰辅酶
10、 A 还原酶 XIC Extracted ion chromatogram 提取离子流色谱图 RCT Reverse cholesterol transport 胆固醇逆转运 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究 研究生：李小华 导 师：姜宏梁教授 摘 要 苦丁茶（Ilex kudincha C.J.Tseng）是冬青科冬青属乔木植物的嫩叶，为药食 同源的常用中药。为阐明苦丁茶皂苷降血脂的药效物质基础，本论文以高脂血症 小鼠模型对其降血脂活性进行了确证，同时利用实时定量 PCR 技术初步阐明了 苦丁茶皂苷降血脂的作用机理， 并运用超高效液相飞行
11、时间串联质谱技术对苦丁 皂苷部位的化学成分进行了全面的表征， 为苦丁茶的开发和利用提供了新的科学 依据。 方法：采用硅胶柱色谱层析、反相 C 18 半制备等传统的植物化学分离模式， 对苦丁茶皂苷成分进行分离并进行结构鉴定。结合 QTOF-MS/MS 对苦丁茶皂苷 提取物中的所有皂苷成分进行结构表征。通过高脂饲料建立高脂血症小鼠模型， 随机 4 组，即苦丁茶皂苷 TS L 组（50 mg/kg ）、 苦丁茶皂苷 TS H 组（100 mg/kg ）、 P group（simvastain tablets 20 mg/kg ）、 H group 组，另取同步饲养的正常小鼠作 为 C group 组
12、，每组 8只，连续灌胃给药 4周后，眼眶后静脉丛取血，分离血清， 检测所有小鼠血清中一系列生化血脂指标变化；油红 O 染色观察肝脏组织病理 形态学。然后从基因表达方面采用实时定量 PCR 的方法研究实验小鼠肝脏中与 脂代谢相关的五种基因的表达情况，初步阐述苦丁茶皂苷降血脂的作用机理。 结论：共分离出 6个化合物分别是： kudinoside A 、 kudinoside D、 kudinoside F、ilekudinoside R、ilekudinoside D、ilekudinoside M，并表征出 52个皂苷累化 合物，为苦丁茶皂苷降脂药效物质基础和质量控制奠定了基础。药效结果发现与
13、模型组比较，苦丁茶皂苷治疗组小鼠血清中 TC、LDL-C、AI 均显著减低，证明 苦丁茶皂苷提取物对高脂血症有显著的预防作用； 肝脏组织染色结果显示苦丁茶 皂苷提取物能改善高脂饲料引起的肝脏脂肪变性；实时定量 PCR实验结果表明 与高脂模型组比较，苦丁茶皂苷提取物能够显著上调高脂血症小鼠肝脏中的 Hmgcr、LDL-R、SR-BI、SR-A和 CD36水平，从基因表达方面初步阐明了苦丁 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 茶皂苷的降血脂药效作用靶标和作用机理。 关键词 苦丁茶皂苷；高脂血症；超高效液相飞行时间串联质谱；清道夫 受体 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位
14、 论 文 4 A study on composition and hypolipidemic effect of total saponins from Kuding tea Abstract Ilex kudincha C. J. Tseng is belonged to the Aquifoliaceae family, the leaves of Ilex kudingcha are used as an ethnomedicine in the treatment of symptoms related with diabetes mellitus and obesity throu
15、ghout the centuries in China. Nowadays it becomes the research topic in the study of functional food medicine for the treatment of cardiovascular-related diseases, diabetes mellitus and obesity. In the present study, the bioactive components of Kuding tea was systematically studied using UPLC-QTOF-M
16、S/MS and the mechanism of their lipid lowering effects was studied by the method of RT-PCR from the perspective molecular biology. The results will provide novel evidence for the development of Kuding tea. The saponin standards were isolated and purified by means of D101 macroporous resins, silica g
17、el and C 18column chromatography. The structures of the 6 isolated compounds were elucidated by MS compared with that of corresponding standards reported. Finally, the 6 compounds were identified as kudinoside A, kudinoside D, kudinoside F, ilekudinoside R, ilekudinoside D and ilekudinoside M. The f
18、ragmentation patterns of 6 saponin standards were investigated and the composition of TS extract from Kuding tea was analyzed by UPLC-QTOF-MS/MS with full scan mode in both positive and negative modes. As a result, fifty-two saponins were identified or characterized in TS extract from kuding tea. Th
19、e hypolipidemic effect was evaluated in high-fat diet (HFD) induced hyperlipidemia mice. The male kunming mice were divided into four groups, namly control group, hyperlipidemia mode group and two dose groups including the low and high doses of TS extract from Kuding tea (50 mg/kg and 100 mg/kg). Af
20、ter administered by gavage for 4 weeks, the level of serum TC, LDL-C, HDL-C and AI were determined. _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 Simultaneously, the mice were sacrificed and the liver pathology was observed by the photographs stained with oil red-O staining. The results showed that hepatic steatosis
21、caused by HFD in mice had been improved correspondingly in a dose-dependent manner after treated with TS extract from Kuding tea for 4 weeks. Meanwhile, TS extract significantly up-regulated the gene expression of hepatic scavenger receptors including SR-Al, SR-BI and CD36. Therefore, it is reasonab
22、le to assume that the over expression of hepatic scavenger receptors was involved in the hypolipidemic effect of Kuding tea on the high-fat diet-induced hyperlipidemic mice. The TS extract could influence these scavenger receptors, and this could be the potential mechanism of TS extract from Kuding
23、tea in the treatment of lipid disorders. Keywords: saponins of Kuding tea, hyperlipidemia, UPLC-QTOF-MS/MS, scavenger receptors. _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 引 言 随着人们饮食结构的改变，高脂血症发病率节节攀升，据世界卫生组织统计 中国 13 亿人中血脂异常占 18.6 % 1 。脂代谢异常又称高脂血症，其发病的原因 是机体脂代谢失去平衡，有关的物质大量积累，引发肝脏出现问题和血管血栓沉 淀等疾病，极大地威胁着人们的生命健康2 。目前市场
24、上降血脂的药物大多为 他汀类药物，但是预防这一类疾病的药物却很少，因此为预防心脑血管疾病的发 生发展，从药食同源中草药中寻找安全有效的预防降血脂药物具有重要意义。 苦丁茶（Ilex kudincha C.J.Tseng）是中国历史悠久的特种茶,民间饮用苦丁茶 的人认为苦丁茶具解腻、消渴化食、降脂、清热解毒和减肥等保健功效，被称之 为“减肥茶”和“美容茶”。其化学成份主要为三萜及甾醇类。现代医学研究证明， 苦丁茶具有很好药理疗效作用3,4,5 。但是，有关苦丁茶皂苷降脂药效物质基础 及其作用机理仍不明确。 本课题采用大孔树脂富集纯化苦丁茶皂苷提取物， 运用植物化学分离模式分 离苦丁茶主要皂苷化合
25、物（第一章） ；基于 UPLC-QTOF-MS/MS 技术对其化学 成分进行了表征和鉴定（第二章） ；苦丁茶皂苷降血脂作用机理从血清一系列生 化指标变化、肝组织形态学观察以及基因表达方面进行了研究（第三章） ，为苦 丁茶降血脂作用提供新的理论依据。 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 第一章 苦丁茶中皂苷类化合物的提取分离及结构鉴定 1 前言 苦丁茶的化学成分主要包括黄酮类和皂苷两大类成分。 其中黄酮类包括绿原 酸和异绿原酸，皂苷类主要为五环三萜皂苷。Nishimura Keiichi 等从苦丁茶冬青 的水提取物中分离出七种已知三萜皂苷，十种新的三萜化合物 6,，7 。本章
26、主要内 容是对苦丁茶皂苷类成分进行分离，获得纯度大于 99 %苦丁茶中主要皂苷类成 分的化合物，用于苦丁茶皂苷类成分的质谱裂解规律研究，为苦丁茶皂苷成分的 全面表征奠定基础。 2 实验仪器及材料 21实验仪器 中压制备液相 （Rters， ORTQP） ,半制备型高效液相色谱 （Wcret P680系列） , 分析型高效液相色谱 （Qrry 2356） ， 旋转蒸发器 （申生科技公司） ,QT PTTY Triple TOF 5600（QT SCIEX 公司） ，核磁共振仪（WeeekQW-567） 2.2实验试剂 苦丁茶（产地：海南，由亢津药业有限责任公司提供） 、 Methanol （ch
27、romatography pure， USA merck ）， Methanol、dichloromethane、Petroleum ether、 acetone（ analytically pure，贝井化学公司） ， methanol-d4， (Methyl sulfoxide)-d6（纯度 99%，Cambridge Iostope Laboratories） ，层析住（50 mm 460 mm， 11 mm 500 mm，慧德易公司） ，硅胶 200300目，薄层层析用硅胶 H（红 甲科技有限公司） ，C18填料（Wterd Aercr） ，C18半制备色谱柱（250 10 mm， 5
28、m，QPV，Qcxs） ，D101 大孔吸附树脂（蓝晓新材料科技股份有限公司） ，中 低压半制备柱（100 2.5 cm） 2.3实验材料 苦丁茶由亢津药业有限责任公司提供， 并经恩施州食品药品检验检测中心吴 绍敏主任鉴定，其批号为 20130732。 3实验方法 _ 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 3.1苦丁茶皂苷提取物的制备 称取干燥的苦丁茶 10 kg，加水浸没，再加入水，加入量为药材量的 10倍， 把水煮三次，每次两个小时，合并提取液，浓缩，冷冻干燥。经蒸馏水溶解，上 D101 大孔吸附树脂柱先用 30%乙醇 20 倍柱体积量洗脱至淡黄色，接着用 70 ml 无水乙
29、醇加水至 100 ml 的溶液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥成冻干 粉得到 B部分（即苦丁茶皂苷提取物 ）。 3.2苦丁茶皂苷的分离 先称取苦丁茶皂苷提取物，采用不同展开剂展开，其展开剂为二氯甲烷与甲 醇比例（50:1、 25:1、 15:1、 10:1、 5:1、 3:1、 1:1）以及乙酸乙酯与甲醇比例（50:1、 25:1、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1） ，比较展开后斑点 Rf 值，发现二氯甲烷与甲 醇（3:1）为展开剂 Rf值比较适中。最终选用二氯甲烷与甲醇做为薄层层析洗脱 剂。用紫外做苦丁茶皂苷提取物全程扫描，发现苦丁茶皂苷最大吸收波长在 205 nm。 称取苦丁
30、茶皂苷提取物 100 g 备用，称取 6 公斤薄层硅胶 H 倒入入大容器 中，配二氯与甲醇（10:1）的溶液，搅拌，静置一会，搅拌后，倒入层析柱中， 使薄层硅胶一层层夯实，完成后薄层硅胶上面预留高出薄层硅胶 2 cm，将称好 的苦丁茶皂苷提取物 100 g缓缓加到薄层硅胶上，注意苦丁茶皂苷提取物时不能 太快， 这样容易产生气泡。 分别用 10倍柱体积二氯与甲醇 （10:1） 、 （7:1） 、（ 5:1 ）、 （3:1） 、 （1:1）进行洗脱，将收集的洗脱液用用二氯甲烷与甲醇（3:1）的溶液 作为展开剂，将相同斑点的溶液混合。TLC检测采用10 %硫酸乙醇溶液为显色剂 进行显色，各流分浓缩，得 B1B5，共 5个流分。 将流份 B4（二氯甲烷：甲醇（3:1）洗脱下来）经半制备中低压 C 18 色谱层析 进一步纯化，流动相的选择分别采用甲醇与水比率为:20 %、40 %、 60 %、70 %、 80 %进行分离效果监测，结果甲醇与水比率为 80 %进行中低压半制备分段，分 成两段，分别收集两段溶液，浓缩。 最后将分段的两种溶液进行半制备 HPLC 纯化，流动相的选择分别采用甲醇 与水比率为:20 %、40 %、60 %、70 %、80 %进行分离效果监测，结果甲醇与水 _