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1、精制抗狂犬病血清精制抗狂犬病血清 3 3 效价效价 IUIU 测定方法测定方法1 1 中和用病毒悬液的制备中和用病毒悬液的制备要求中和用病毒悬液经 37水浴作用 1 小时的 LD50在32320 之间。1.1 病毒株的选择：选用 CVS 毒种。1.2 病毒株的传代：取 CVS 毒种（一般为冻干毒种）制成10-2 悬液，脑内接种体重 1012g 健康小白鼠 0.03ml，待发病后取脑再制成 10-2 悬液，接种于小白鼠脑内进行传代，一般传至 23 代即可制成冻干中和用病毒或70冻存的中和用病毒，但要选用小白鼠在第 5 天发病并麻痹的服制备。1.3 冻干病毒的制备：用第 5 天发病并麻痹的鼠脑以脱
2、脂牛乳研磨稀释成 20%的脑悬液，按 0.5ml 分装安瓿冻干后真空封口，存-30待用。1.4-70冻存病毒的制备：用第 5 天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成 10-1 悬液，经2000r/min20 分钟沉淀，取上清混匀后分装小管，存-70冰箱待用。1.5 病毒悬液的预测1.5.1 冻干病毒的预测：取含 20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入含 2%小牛血清 PBS1.0ml，吹打均匀后再用 4.0ml 上述稀释液与病毒液充分混匀，1500r/min 沉淀 10 分钟，取上清与等量的稀释液混合则为 10-2悬液，然后再用 10-3、10-4、10-5、10-6稀释，从 1
3、0-6至 10-2各取 0.5ml 加入 5 个小管内，每管再加入2%小牛血清 PBS0.5ml，放置 37水浴一小时。用体重 1012g小白鼠 30 只，分成 5 组，每组 6 只，经用 37作用的 10-6至10-2病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种 6 只小白鼠，每只小白鼠脑内接种 0.03ml，观察 14 天，每天观察小白鼠发病死亡情况，接种后 4 天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。以接种 5 天后的发病死亡小白鼠统计 LD50。1.5.2-70冻存病毒悬液的预测：取含 10%脑悬液的冰冻病毒用流水融化后即为 10-1 悬液，然后再做 10-2 至 10-7 稀释。从 10-7 至 1
4、0-3 各取 0.5ml 加至 5 个小管内，每管再加入 2%小牛血清 PBS0.5ml，放置 37水浴 1 小时，用体重 1012g 小白鼠 30 只，分成 5 组，每组 6 只，用经 37作用的 10-7至 10-3病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种小白鼠 6 只，每只小白鼠脑内接种 0.03ml，观察 14 天，每天观察小白鼠发病死亡情况。接种后 4 天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。以接种 5天后的发病死亡小白鼠统计 LD50。1.5.3 按以上二种病毒的悬液预测的结果计算 LD50。将用其100 个 LD50的病毒稀释度作为中和用病毒悬液稀释倍数，用于小白鼠中和试验。2 2 小白鼠的
5、准备小白鼠的准备用作中和试验的小白鼠必须是未进行过其他试验的健康小白鼠，体重为 1012g。3 3 中和试验中和试验3.1 狂犬病血清中和试验用的血清参考标准品：由中国药品生物制品检定所提供，或用经检定所认可的各生产单位工作用参考标准品。3.2 待检定血清样品的稀释：取有代表性的血清样品，按二倍连续稀释的方法用 2%小牛血清 PBS 进行稀释，一般可采用1800、116001102400，但可根据血清实际效价的情况适当减低或提高试验时最低稀释倍数，如采用上述 8 个稀释倍数，则用待检血清按 2.7ml 稀释液加入 0.3ml 血清作为110，然后再用 3.5ml 稀释液加入混匀的 110 倍的
6、血清0.5ml 为 180，再按 2.7ml 稀释液加入 0.3ml 为 1800。然后均按 0.5ml 加 0.5ml 稀释的方法制成1800、1160011024008 个稀释倍数，以上 8 个稀释倍数的不同稀释度分别以 0.5ml 加入 8 个小试管内待用。3.3 效价检定用血清标准品的稀释：方法同待检血清样品的稀释。如用检定所的 85RS 国家标准品，稀释度应从 180 开始，其国际单位为 26.53/ml。3.4 中和用病毒悬液的制备：按病毒悬液预测的 100 个LD50 的稀释度作为中和用病毒悬液。3.5 中和：将上述 3.2 项的 8 个稀释度的各装 0.5ml 的 8支小试管和
7、 3.3 项的 8 个稀释度的各装 0.5ml 的 8 支小试管共16 支小试管各加入中和用病毒悬液 0.5ml，放置 37水浴 1 小时，作注射小白鼠用。另用相同体重的小白鼠测定中和用病毒悬液的实际 LD50。其方法可将中和用病毒悬液作为原液再稀释10-1、10-2、10-3 四个稀释度，以上 4 个稀释度各加入 0.5ml于小管内，每管再加入 2%小牛血清 PBS0.5ml，同样放置 37水浴 1 小时作为中和病毒对照。3.6 接种小白鼠：将已中和的待检血清和血清标准品的不同稀释度的悬液和病毒对照接种小白鼠，血清按从浓到稀的倍数接种小白鼠，而病毒对照则按从稀到浓的倍数接种小白鼠。每只小白鼠脑内接种 0.03ml。3.7 观察：共观察 14 天，每天记录小白鼠的发病死亡情况，接种后 4 天死亡的小白鼠作为非特异性死亡计。4 4 待检血清效价待检血清效价按下列公式计算：相对效力=待检血清 ED50 的倒数/血清标准品 ED50 的倒数血清效价（IU/ml）=相对效力血清标准品的国际单位