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1、医学分子生物学杂志 , 2007, 4 ( 1 ): 86 90 J M ed Mol B io,l 2007, 4 ( 1): 86 90 基因敲除技术现状及应用 万海英 综述 汤华 审阅 天津医科大学天津市生命科学中心实验室 天津市 , 300070 摘要 功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得 尤为重要。基因敲除技术从 载体构建到细胞的 筛选 到动物模型的建立各方面都得到 了发展。其中 Cre LoxP 系统可以有效的控制打靶的发育阶段和组织类型 , 实 现特定基因在特定时间和 (或 ) 空间的功能研究 ; 转座子系 统易于操作 , 所需 时间短 , 具有高 通量的特点 , 可以携带多
2、种抗性标记 , 方便了同时进行多基因功能研究 ; 基因捕获技术提供了获得基因敲除小鼠的 高效方 法 , 方便了进行小鼠基因组文库的研究。此外 , 进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒 子交 换法也从不同方向发展了基因敲除技术。 关键词 基因敲除 ; Cre L oxP 系统 ; 转座子 ; 中图分类号 R 349 8 基因捕获 Statu s Quo and App lica tion WAN H aiy ing, TANG H ua of G ene K nockou t T ianjin M ed ical University, T ianjin L if e S cienc
3、e Center, T ianjin, 300070, China Abstract G ene knockout is i portant for funct ional genom ics G reat prog ress has been m ade in the vector construction o f gene knockou, screen ing of ai ed ce lls and an i alm odels and the deve lop m ents in these fields help to so lve the prob lem s in the stu
4、dy of genom ic functions C re LoxP system can effect ively contro l the developm ent stage and histology of gene knockou, b le to study gene funct ion in a g iven ti e and / or space T ransposon system thereby m aking it possi is easy to m anipulate, quick and can achieve high throughpu, carry m ult
5、 iple resistance m arker gene, wh ich m akes si ulta neous study of m ultip le genes possib le G ene trapp ing prov ides a high ly efficient m ethod of obtain knockout m ice and can facilitate the research of m ice genom ic library In addition, the techn iques such as ! h it and run, ! doub le repla
6、cem ent, ! tag and exchange and ! recom binase m ediated cas sette exchange K ey word s all contribute to the developm ent o f gene knockout technology gene knockou, Cre LoxP system, transposon; gene trapping 基因敲除又称为基因打靶 , 是指从分子水平上 胞核内 ; % 筛选目的细胞 ; &转基因动物。 将一个基因去除或替代 , 然后从整体观察实验动物 , 基因敲除传统的重组载体主要有插入
7、性载体系 推测相应基因功能的实验方法。基因敲除技术是功 能基因组学研究的重要研究工具。 基因敲除技术是在 20世纪 80年代后半期应用 DNA 同源重组原理发展起来的。胚胎干细胞 ( em bryonic stem ce ll, ES 细胞 ) 分离和体外培养的成功 及哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除 的技术基础和理论基础 。基因敲除主要包括下列 技术 : # 构建重组载体 ; 重组 DNA 转入受体细 通讯作者 : 汤华 (电话 : 022 23542603, E m ai: h tang2002 yahoo com ) C orrespond ing author: TANG H
8、 ua ( Te: 86 22 23542603, E m ai: htang2002 yahoo com ) 统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时 主要包括要插入的基因片段 (目的基因 )、同源序 列片段、标志基因片段等成分 , 替换性载体系统主 要包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基 因等成分。基于正负双向筛选 ( posit ive and negative se lection, PN S) 策略的传统方法的基因敲除需要满 足 : 对基因组提取处理用于构建载体 ; 需要位于打 靶区两翼的具有特异性和足够长度的同源片段 , 并 便于用其作为探针用 Southern 印迹证实
9、 ; neo 基 因 ( 新霉素磷酸转移酶基因 ) 的整合 ; 同源重组区域 外侧 tk 基因 (胸苷激酶基因 ) 在随机重组时的活 性 ; 打靶结构外特异的基因探针 ; 合适的酶切位点 , 1 医学分子生物学杂志 , 2007, 4 ( 1 ): 86 90 J M ed Mol B io,l 2007, 4 ( 1): 86 90 ( 87( 9 10 便于用Southern 印迹证实过程中出现特异大小条带。 可得到删除外源标记基因的条件 性敲除小鼠 , 重组后不能排除由于基因对位置改变产生的影响 , 长距离 PCR 中特殊序列的技术问题 , 不能控制打靶 的组织类型及发 育时段 , 需时
10、较长花费较大 , 这些 都限制了 研究工 作的进 行。近年发 展起 来的 Cre LoxP 系统或 F1p FRT 系统及转座子系统、基因捕获 技术。分别从不同方面解决了上述基因敲除中的问 题。 1 C re LoxP 系统 Cre LoxP 系统属于传统的同源重组载体 , 但是 具有了时空调控的功能。它由 Cre 重组酶和 LoxP 位 点两部分组成。前者来自 E. coli 噬菌体 P 的 Cre 基 因 , L oxP 由 2 个 13 bp 的反向重复序列和 1 个 8 bp 的间隔区域构成。 Cre 是 1 个 38 ku 的重组酶蛋白 , 它可以介导 LoxP 的 34 bp 重复
11、序列的位点特异性重 组 , 切除同向重复的 2 个 L oxP 位点的 DNA 片段和 1 个 LoxP 位点 , 保留 1 个 LoxP 位点 。 与传统的重组载体相比较 , Cre LoxP 的不同点 包括 : 在被 Cre 重组酶介导的重组发生前内源基因 功能正常 , 对基因组的任何改造必须位于编码区以 外或者内含子区并且不干扰调节区域的功能 ; 根据 删除片段的要求改变 LoxP 位点的插入方式可以得到 不同的重组体 ; 每 段被改造的 DNA 片段都含有酶切 位点便于用 Southern 印迹证实 ; 便于区分打靶后不 同细胞类型 ( 野生型、打靶但未重组型、重组型 ) 的显像策略。
12、 研究者发现 , 在不同时期通过导入 Cre 重组酶 , 可以精确控制基因重组的时段。将该系统用于条件 性切除小鼠成熟 Schw ann 细胞有丝分裂期和有丝分 裂后期 M at1 蛋白 , 揭示其在转录中是调节性作用而 不是必需的成分 。 C re 不仅可以识别 LoxP 的 2 个 13 bp 的反向重复序列和 8 bp 的间隔区域 , 而且当 一个 13 bp 的反向重复序列或者 8 bp 的间隔区发生 改变时仍能识别并发生重组 。利用这一特点 , 人 们在进行构建载体时可以根据需要改造 L oxP 位点序 列用于基因突变或修复 , 增加了该系统的应用范围。 重组酶介导的盒式交换 ( r
13、ecomb inase m ed iated cas sette exchange, RM CE) 方法就是以 8 bp 的间隔区 发生改变为基础构建的 ; 同时结合盒式交换来突现 动物的表型而易于鉴别 。 Cre LoxP 系统既可以在细胞水平上用 Cre 重组 酶表 达质粒转染中靶细胞 , 通过识别 LoxP 位点将抗 性标记基因切除 ; 又可以在个体水平上将重组杂 合子小鼠与 C re 转基因小鼠杂交 , 筛选子代小鼠就 用该系统删除小鼠 X 染色体雄激素受体基因产生雄 激素受体基因缺失小鼠 , 揭示了雄激素受体功能是 正常雌性动物生产能力所必需的 , 雄激素受体是一 种治疗卵巢功能早衰
14、的潜在的治疗性靶基因。或者 将 C re 基因置于可诱导的启动子控制下 , 通过诱导 表达 C re 重组酶而将 LoxP 位点之 间的基因切除 (诱 导性基因敲除 ) , 实现特定基因在特定时间或者组织 中的失活 , 例如应用四环素诱导的开关系统诱导 C re 重组酶的暂时表达 , 来调节 R osa26 的表达。 C re L oxP 系统还可以用于染色体间的基因重排。 通过在特异性位点同源重组导入含有 LoxP 序列的 5 H p rt 框 , 然后随机整合含有 L oxP 序列的 3 prt 框 , 在 C re 酶的作用下 , 两个 L oxP 位点之间发生重组 , 形成具有功能的
15、H p rt 微小基因 , 使重组后的 ES 细 胞在选择培养基中存活下来。这种染色体重排为染 色体功能图谱的制作提供了一个很好的技术手段 。 总之 , Cre LoxP 系统可以实现对基因的不同发 育阶段、不同组织类型中特异性的删除 , 可以消除 由于基因位置改变造成的影响 , 加强了对基因的控 制能力 , 使研究者可以更方便地有针对性地进行目 标阶段的研究工作 ; C re L oxP 系统可以实现染色体 间的基因重排 ; 但同时也可以看出该系统对基因的 了解要求极高 , 并且对基因片段的操作能力要求也 很高 , 基因片段的大小通常在 10 kb 以上 , 这些都 不利于研究工作进行。 2
16、 转座子系统 转座子 ( transposon ) 是在多 种生物 ( 包括玉 米、蠕虫、昆虫、人类等 ) 中可被识别的可以移动 的基因单位。它的结构主要包括双侧末端重复序列 及中间的抗性基因、转座酶读码框等。转座子系统 自从 20 世纪 50 年代被 M cC lintock 发现以来 , 已经 成为许多组织器官进行基因分析的工具。在人和小 鼠的基因组中 , 转座子衍生序列多达整个基因组的 40% , 这提示在发育过程中转座子有重要作用。 睡美 人转 座子 ( sleep ing bueaty, 转 座子 SB ) 已证明在小鼠和人细胞中可以激活 , 但是转座子插 入序列被限制并集中于起始位
17、点附近 , 从而限制了 DNA 片段的携带。在最近的研究中发现 , SB 转座子 通过再觉醒机制激活后可以稳定的表达所携带的基 因 , 使研究者又开始关 注其发展 。夸娥转座子 ( piggyBac, PB 转座子 ) 的发现成功地解决了 DNA 片段的携带限制这一问题。 PB 转座子有 2 472 bp, 有 13 bp 的反向末端重复序列和一个 594 个氨基酸 的 2 6 7 3 8 6 ( 88( 12 万海英 , 等 . 基因敲除技术现状及应用 转座酶 。 PB 转座 子插入四 核苷酸 TTAA 位 点。 一种产生基因敲除小鼠的高效方法。条件性基因捕 PB 转座子能有效地在非同源染色
18、体 上发生重组且几 乎唯一地发生在 TTAA 位点。 PB 转座子能整合进入 小鼠基因组且无明显的染色体区域性选择。而且 PB 转座子单元能携带复杂的标志基因 , 并准许这些基 因在不同的插入位点表达。 PB 转座子已成为有力的 基因插入工具 , 它在基因插入时很少引起基因组破 坏。对于插入突变基因的 PB 转座子也能携带报道基 因来提高 /促进删失或基因捕获 , 这能极大地促进小 鼠基因组的研究 , 并提供多种生物分析类型的模式。 目前研究报道 , 能用于任何物种的转座子打靶 载体是以两种以噬菌体 M u 为基础的 m in iMu 转座 子 , 它们可以通 过在拟删除基 因两侧各插入 一个
19、 m iniM u 转座子 ( 其中一个转座子携带有一个适用 于哺乳动物细胞筛选的抗菌素抗性标记基因 , 另一 个转座子携带另外一个适用于哺乳动物细胞的抗菌 素抗性标记基因 ), 或者由 L oxP 诱导的重组 , 或通 过连接后限制性消化而在两个 转座子之间产 生缺 失 。这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的 部分重移 , 留下一个带有选择性标记的在两侧与靶 基因同源的臂。该系统过程的大多数步骤会自动考 虑到高通量打靶载 体的产生。由于没必要用 PCR 方 法扩增同源的侧臂 , 这样减少了由 PCR 产生错误的 机会 , 而这些错误将降低打靶的效率。这个过程不 需要直接从基因组片段克隆 ,
20、 而且在基因组 DNA 不 需要限制酶位点 ; 不需要已知基因组序列 , 仅已知 外显子序列即可。与传统的载体构建方法相比较 , 该方法迅速且技术简单 , 载体通常在两周内产生 , 可以携带多种不同抗性基因 , 可以同时处理多基因。 但其应用范围有限 , 适用于有一段克隆到的原始基 因组序列 , 长度在 10 15 kb, 且转座子应满足以 下 条件 : # 转座子本身应该很短 , 易于操作 , 并对任 何期望敲除区域有高效率 ; 在删除目的区域后应 留下足够长的两臂用于同源重组 。而且由转座子 产生的重组载体缺少传统载体那样的明确性。这些 都限制了转座子的应用。 3 基因捕获载体系统 基因捕
21、获技术是将突变基因导入小鼠 ES 细胞 从而获得小鼠基因组文库 , 进行小鼠基因组的功能 研究 , 它属于大规模随机敲除。典型的基因捕获载 体通常包括一个无启动子的报道基因 , 并通过调控 元件使含有小鼠基因组文库的 ES 克隆很容易被选择 性培 养基筛选出来 。 与单向插入技术相结合的基因捕获技术提供了 获载体被随机地整合入小鼠的胚胎干细胞基因组中 的方式为 : 通过准许整合位点的识别、可以通过重 新移动捕获基因盒子的等位基因而再激活、伴随条 件性捕获基因的灭活而灭活。条件性基因灭活的基 础是当一个基因元件被插入到一个内含子中间时是 转录静止的 ; 当通过位点特异性重组被转化时从整 合位点处
22、该元件破坏内源性 mRNA 产物。该载体的 特点为 : # 插入的 DNA 载体在激活前是转录静止 的 ; 伴随着单向插入 , 载体强有力地破坏转录 ; % 单向插入的碱基盒子能在细胞和转基因鼠中有效 地获取 ; &基因捕获技术导致在内源性基因中有无 数的单个内含子插入 ; ) GT 盒子能被移动离开转 录静默插入元件 ; 插入位点很容易确定 。这 种载体可以极大地节省中靶细胞的筛选工作而节省 时间和工作量。 启动子捕获载体是一种选择性标记基因的 mR NA, 仅当基因捕获载体被置于一个被捕获基因的一 个已激活的启动子的控制下时才被转录 , 并可有效 地灭活 基因的方法 , 但是在靶细胞中转录
23、静默位点 通过这种策略是不能被识别的 。该载体设计减少 了非功能 DNA 片段被捕获进入 ES 细胞而造成假相 的机率。这种 mRNA 依次监视途径使得在 ES 细胞 中用一种新的无偏倚多聚 A 策略 ( unb iased po lyade ny lation, U PA ) 捕获基因的多种下游外显子的操作 成为可能。通过 UPA 捕获策略使无意义密码子介导 的信 使 RNA 的衰 变 ( nonsense m ediated mRNA de cay, NMD ) 抑制准许基因捕获技术可以忽视它们在 靶细胞中的转录地位 , 在载体整合位点无偏差。传 统的 po lyA 捕获技术能被用于更特别
24、的目的包括下 效基因或 C 端标记的等位基因的断裂基因的产物。 这两种多聚 A 捕获策略的组合使用 ( 如 U PA 捕获技 术和传统的方法 ) 将显著增加由随机的基因内载体 整合引起的差异 。 基因盒子交换捕获系统在动物模型的发展中有 重要应用 , 特别是以等位基因异质性为特征的人类 基因性疾病的模型 。通过基因盒子交换系统捕获 的疾病位点能很容易的用突变的 cDNA 多次重复操 作 , 这样准许用各种导致疾病的突变的等位基因来 替换野生型的等位基因。该系统能被用于大量带有 不同启动子驱动表达的带有标记基因的 ES 细胞的收 集。这些标记可能成为潜在的在特殊的组织中或可 复现的方式中某种转基
25、因表达的标准插入位点。在 这种策略的潜在应用中能用于构建在相同位点表达 报道基因 ( 半乳糖 , 胎蛋白 等 ) 的标记的 ES 13 14 15 16 医学分子生物学杂志 , 2007, 4 ( 1 ): 86 90 J M ed Mol B io,l 2007, 4 ( 1): 86 90 ( 89( 细胞的收集 , 如有位点特异性重组酶 ( 如 Cre) 或 连接蛋白 43 与骨骼肌的再生与分化的关系中构建的 在不同组织有药物诱导和可逆的基因表达的反式作 用因子 (如 tTA, rtTA 等 ), 或对细胞部份切除研究 有毒性编码基因 (如 tk, DTA ) 。总之 , 基因捕获 技术
26、可以在 ES细胞中有效的、可靠的捕获基因 , 迅 速建立基因文库的动物模型 , 而在国际基因捕获协 会 ( the internationa l gene trap consortium, IGTC ) 成 员的网站内共提供了 44 605 种基 因捕获细胞系的信 息 , 极大方便了基因功能的体内研究 。 4 H it 和 R un 法 人类疾病中许多是由于基因点突变引起的功能 异常 , 如人类镰状红细胞贫血就是由于编码血红蛋 白 链第 6 位谷氨酸 ( GAG ) 被缬氨酸 ( GUG ) 取 代所引起的。但这种基因病无法用整个基因敲除的 方法获得相应的疾病模型。因此研究者将精细突变 引入到
27、基因研究工作中来。 H it 和 R un 法也称进退 策略。它包括两次同源重组 : 第一步 ( H it) 用插入 型载体进行同源重组 , 在靶位 点插入带有突变的基 因组序列以及带有两个筛选标记 (如 neo 和 tk ) 的 载体序列 ; 第二步 ( R un) 利用 tk 抗性筛选 , 富集 发生去除了含有负筛选标记基因的载体序列的回复 突变的克隆。 LAKHLAN I 等 就是用该方法将肾上 腺素能受体 ( a2a adrenergic receptor, a2A AR ) 的 第 79 位的天冬氨酸突变成天冬酰胺 , 产生了肾上腺 素能受体功能缺陷小鼠。 H it 和 R un 法
28、的不足之处 是 : # 无法精确控制染色体内的同源重 组 , 可能会 失去携带突变的同源序列 , 而保留未修饰的内源片 段 ; 整个过程需要采用两种培养基分别进行先后 两次筛选 ; % 无法同时引进多个位点突变。 5 双置换法 双置换法 ( double replacem ent) 也属于精细突 变敲除。它首先用含有 H p rt 基因的打靶载体 转染 H prt ES 细胞 , 通过在次黄嘌呤 、氨喋呤和脱氧胸 腺嘧啶苷 ( hypoxanth ine, am inopterin and thym idine, HAT ) 培养基中筛选并用 PCR 进行基因组分析 , 筛 选发生同源重组、
29、H prt 基因阳性克隆。然后用只携 带突变同源序列的打靶载体转染上一步获得的 H p rt ES 细胞。同源重组发生后 , 突变序列将 H prt 置换出 来。 H p rt 细 胞可在 6 巯基鸟 嘌呤 ( 6 th ioguan ine, 6 TG ) 培养基上筛选并用 PCR 进行分析。这种方法 的优点在于 , 第一步获得的 H prt ES 细胞 , 除了可 用于产生普通的基因剔除小鼠外 , 也可以作为将不 同突变引入靶基因的基础 。 A raya 等在研究间隙 19 20 - + - + 21 22 间隙连接蛋白 43 表达异常小鼠就是用这种策略。 此外 , ! 标记和置换 法 (
30、 tag and exchange)、 重组酶介导的盒式交换法等也属于精细突变 , 它们 与双置换法有许多共同之处。 ! 标记和置换 法是 同源重组插入正负筛选标记基因 (如 neo, H prt, tk ) 对靶基因进行 ! 标记 , 然后用在同源序列上带有 精细突变的载体来转染上一步得到的 ES 克隆 , 带有 精细突 变的 同 源 序列 将 置 换被 ! 标记 的靶 基 因 。重组酶介导的盒式交换法是用重组酶将插 入到基因组指定位点的基因盒与另一交换盒在重组 酶作用下发生重组交换 , 来改变基因表型 。 6 展望 基因敲除在 20世纪 80年代发展起来后已经应 用到许多领域 , 如建立人
31、类疾病的转基因动物模型 ( 糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等 )。这些 疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病 的研究 : 研究发育过程中各个基因的功能 , 研究治 疗人类遗传性疾病的途径。 随着分子生 物学的发展 , 多种基因载体的构建 方法的发展使基因敲除技术得到了快速发展 , 如将 传统载体上的抗性标记基因用荧光基因替代 , 并结 合单细胞的分离技术大 大缩短中靶细 胞的筛选时 间 , 加快基因敲除的进程。 与此同时 , 其他基因删失的方法也得到迅速发 展 , 最显著应用的为 RNA 干扰 ( RNA interference, RNA i) 、反义寡核苷酸技术等。与传统的打靶
32、技术 相比较 , RNA i 的操作简单 , 花费的时间短 , 已经成 为基因删失的重要工具。同时 , RNA i 技术 也已经可 以通过 shRNA 表达盒子能够在细胞中像在动物模型 中一样产生有效的、稳定的和可调节的基因沉默作 用 。但是在基因表达的蛋白的结构异常等研究 中 , RNA i 是无法取代基因敲除的作用的。 参考文献 1 TATEISH I S, N I A H, M IYAZAK I J, et al Enhanced genom ic instab ility and defective postreplication repair in rad18 knockout mo
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