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1、动物医学进展 , 2009, 30( 2) : 78 82 Pr ogress in V et erinary Medicine 荧光定量 P C R 1, 2 技术及其应用研究进展 1* 2 3 * 郭 杨 , 陈世界 , 郭万柱 , 李 璟 ( 1. 四川出入境检验检疫局技 术中心 , 四川成都 610041; 2. 四川农业大学动物生物技术中心 , 四川雅安 625014; 3. 成都理工大学材料与生物工 程学院 , 四川成都 610059) 摘 要 : 荧光定量 PCR 是近年发 展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术 , 它是核酸探针技术 、 荧 光共振能量传递技术和 P CR 技
2、术的有机结合 , 而荧光探针是荧光定量 P CR 的核心 。 荧光定量 PCR 具有特 异性强 、 灵敏度高 、 重复性好 、 定 量准确 、 速度快 、 全 封闭反应等特 点 , 是对原 有 PCR 技术的革新 , 扩大了 PCR 的应用范围 。 论文综述了 FQ PCR 技术的原理 、 FQ PCR 实时定量检测系统及其应用 。 关键词 : 荧光定量 PCR; 荧光探针 ; 检测 ; 应 用 中图分类号 : S854. 43 文献标识码 : A 文章编号 : 1007 5038( 2009) 02 0078 05 自 1985 年 P CR 技术问世以来 , 已研究成功以 义前 3 15
3、个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 PCR 为基础的 扩增和操 作 DN A 序列 的一系 列方 1. 2 循环阈值 法。实时荧光定量 PCR ( real t ime f lur escent quan 循环阈值 ( cy cle t hr esho ld value, Ct) 中 , C 代表 t it ive po1y merase chain react ion, FQ PCR ) 是 基于 cy cle, t 代表 t hreshold。其含义是在 P CR 循环过程 荧光能量传递技术 , 通过受体发色团之间偶极 偶极 相互作用 , 能量从供体发色基团转移到受体发色基 团 ,
4、受体荧光染料 发射出的 荧光信号 强度与 DN A 产量成正比 , 检测 P CR 过程的荧光信号便可得知靶 序列的初始浓度。它融汇 PCR 技术的核酸高效扩 增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高 精确定量的优点 , 直接探测 PCR 过程中荧光信号的 变化以获得定量的结果 。目前已在动植物基因 工程 , 分子生物学研究和医学研究等领域得以应用。 1 两个重要概念 1. 1 荧光阈值 荧光阈值 ( t hresho ld) 以 PCR 反应的前 15 个循 环的荧光信号作为荧光本底信号 , 一般荧光阈值定 中 , 荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点 所对应的循环次数。即每个反应
5、管内的荧光信号到 达设定 阈值的 时刻。 Ct 值 取决 于阈值。 F Q P CR 采用始点定量的方式 , 通过 Ct 值确立样品起始模板 数从而实现定量 , Ct 值与模板 DN A 的起始拷贝数 成反比。同一台 PCR 仪上对相同模板进行扩增 , 在 Ct 值处 PCR 产物数量的重现性极好 , 在 Ct 值处对 起始核酸进行定量 , 此时误差未被放大且扩增效率 也恒定 , 处于线性扩增范围内。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线 , 其中横坐标代表起始 拷贝数的对数 , 纵坐标代表 Ct 值 ( 图 1) 。只要获得 未知样品的表 Ct 值 , 便可从标准曲线上 计算出该样 品的
6、起始拷贝数。 图 1 Fig. 1 F Q P CR 的标准曲线 Standard curve of FQ PCR * 收稿日期 : 2008 11 12 基金项目 : 国家质检总局科研课题资助项目 ( SK 064 02) 作者简介 : 郭 杨 ( 1984- ) , 女 , 四川成都 人 , 硕士 , 主要从事动物传染病病原分子生物学研究 。 * 通讯作者 1 2 郭 杨等 : 荧光定量 P CR 技术及其应用研究进展 79 2 FQ P CR 反应 方法的分类 gro ove binding T aq M an) 探针。其 3!端采用非荧光 性的淬灭基团 , 大大降低本底信号干扰 , 3
7、!连接的一 按照荧光产生的原理 , 可将 FQ 异性 DN A 结合染料法和探针法。 2. 1 非特异性 D N A 结合染料法 PCR 分为非特 个二氢环化吲哚卟啉 三肽 , 稳定了探针与模板的杂 交 , 提高探针的 T m 值 , 使较短的探针可达到较高的 T m 值 , 而短探针 R 基 团和 Q 基团距离更近 , 淬灭效 染料与 DN A 双链结合时在激发光源的照射下 发出荧光信号 , 其信号强度代表双链 DN A 分子的数 量。随 PCR 产物的增加 , P CR 产物与染料的结合量 也增大。不掺入链中的染料不会被激发出任何荧光 信号。染料与 DN A 双链分子的结合是非特异性的 ,
8、 它可以和反应体系中所有 D N A 分子结合 , 易受到非 特异性扩增和引物二聚体的影响 , 使定量结果不可 靠。可用熔解 曲线分析 区分特异 性和非特 异性扩 增 , 引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性 荧光都 有 很 大 帮 助。目 前 主 要 使 用 的 是 SY BR Gr een 和 SY BR G old。一般的染料法灵敏度低 , 特 异性不强。 Po w er SY BR G reen 是最新推出的荧光 染料 , 能非特异地嵌合在 DN A 双螺旋结构的小沟 内 , 结合状态的荧光强度较之游离状态的荧光强度 增强千倍 , 灵敏度可达几个拷贝 / L , 通过熔解曲线 区分
9、特异性和非特异性扩增。在扩增体系中直接加 入 Pow er SY BR Gr een, 避免了设计、标记荧光探针 和使用价格昂贵、复杂的试剂。在操作方面更为简 便安全 , 对环境污染很小。 P ow er SY BR G reen P CR Master M ix 中的热启动酶常温无活性 , 热启动 95 10 min 后才 有 PCR 活性 , 可阻断 配液时的 随机扩 增 , 大大提高了荧光定量 P CR 反应的特异性。 2. 2 探针法 2. 2. 1 Taq M an 探针 也称 水解寡核苷酸探针。 该方法使用具有 5! 3!外切核酸酶活性的 DN A 聚 合 酶。在该探针两端分别标记
10、报告荧光基团 ( R) 和 淬灭荧光基团 ( Q ) 。探针完整时 R 基团发出的荧光 被 Q 基团吸收 , 无荧光产生。若底物序列不能同探 针互补 , 探针仍游离 , 未杂交的探针保持完整 , 荧光 信号不能被检测到。若正确的底物被扩增 , 探针会 在复性阶段与其杂交 , 当聚合酶延伸到探针时 , 会将 其 5!端替换下来 , 并将 R 基团切下 , R 基团和 Q 基 团分开 , 使荧光信号释放出来 , 可通过检测系统观察 到信号的变化 , 荧光信号的累积与 PCR 产物形成完 全同步。每扩增一条 DN A 链就有一个游离的荧光 分子形成 , 实现了荧光信号的累积与 P CR 产物形成 完
11、全同步。利用标准品模板系列绘制出标准曲线 , 结合 各样 品的 Ct 值 , 可确 定样 品的 起初 模板 量。 Taq Man 探针的优点是可利用多种荧光同时进行多 重分析 , 而 SY BR 等 DN A 结合荧光基团 不能。美 国 A BI 公司推出了一种新的 M GB T aq M an( mino r 果更好 , 荧光背景更低 , 短探针也简化探针设计降低 了成 本。 常用 R 基 团有 FA M 、 JO E、 H EX 、 T ET 、 V IC 等 , Q 基团有 T A M RA 、 Eclipse 等。 2. 2. 2 分子信标 它是能与 D N A 杂交的具有茎 环结构的
12、探针 , 环形部分的碱基可与目标核苷酸序 列互补 , 一般为 15 个 30 个核苷酸长 , 茎部是由互 相配对的碱基组成 , 不能与目标基因配对结合。探 针 5!端有荧光标记物 , 3!端有淬灭基团。当无特异 性单链 D N A 时 , 探针自身两端的序列互补 , 形成发 夹结构 ; 淬灭基团吸收荧光标记物发出的荧光 , 以热 量形式释放掉。当该探针与特异模板杂交 , 破坏探 针的发卡结构 , 溶液产生荧光 , 荧光强度与溶液中模 板的量成正比 , 可用于 P CR 定量分析 ; 若目标 D N A 序列同分子信标不能完全配对 , 杂交过程和信号不 会出现。若在发夹结构中荧光标记物不能紧靠淬
13、灭 基团 , 会产生很强的背景信号。若分子信标内杂交 过强 , 会妨碍同目标 D N A 分子的杂交 , 使得荧光信 号不能充分释放。最佳的分子信标应有合适的熔链 特性。分 子信 标可 检测 单个 核 苷酸 的 突变 , 适于 SN P 分析和等位基因突变分析。但设计较难 , 既要 避免产生强的背景信 号 , 又要避免茎部杂交过强 , 影 响其与模板退火 , 从而影响荧光生成。 2. 2. 3 双杂交 探针 Ro che 公司新近开发的一种 PCR 定量技术 , 使用两个杂交探针 , 提高特异性。 2 条探针中的一条在 5!端标记荧光 , 一条在 3!端标记 荧光 , 其中一个为受体荧光基团
14、, 另一个为供体荧光 基团 , 供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团 的激发光谱 , 自由状态时只检测到供体荧光基团发 出的荧光。两探针可与模板同一条链相邻的序列杂 交。退火时两条探针与目的基因特异性结合 , 首尾 连接 , 2 个荧 光基团互相靠近 , 供体基团发出的能量 激发受体基团发出荧光 , 检测时只检测受体基团发 出的荧光。该方法淬灭效率高 , 两条探针均与目的 基因特异性结合才能检测到受体基团发出的荧光 , 检测的特异性增加。但两个探针结合于模板上影响 扩增效率 , 合成 2 个探针 , 成本相对较高。 2. 2. 4 复合探针法 该法结合了分子信标和 L ight Cy cle
15、r 两种技术的优点 , 克服了他们的不足 , 是我国 研究和开发的一种新型定量 PCR 技术。合成两个 探针 , 一是荧光探针 ( 25 bp) , 5!端接一荧光分 子 ; 另 80 动物医学进展 2009 年 第 30 卷 第 2 期 ( 总第 187 期 ) 13 一为淬灭探针 (15 bp) , 3!端接一淬灭分子 , 淬灭探针 义等 采用 F Q P CR 对水疱性口炎病 毒的鉴定检 14 能与荧光探针5!端杂交。无 模板时 , 两探针结合形 测 ; 邹文等 利用 SY BR G reen FQ 15 PCR 检测鸭乙 成复合探针 , 荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收 , 型肝炎病毒
16、 ; Y ang F L 等 建立了检测鸭瘟病毒的 无荧光产生 ; 当溶液中有模板时 , 在较高温度下荧光 FQ PCR 技术 ; 陈玉栋等建立了快速定量检测猪瘟 探针优先与模板结合 , 两探针分离 , 产生荧光。荧光 强度与 PCR 体系中模 板数量成 正比 , 可进行 P CR 定量。该法优点为使用非荧光淬灭剂 , 本底低 , 对扩 增效率影响小 , 探针设计、合成、标记、纯化方便。 3 FQ P CR 在预防 兽医学中的应用 PCR 技术的应用有许多局限 , 不能准确定量 , 假 阳性率太高 , 只要有微量病原体存在就可以得到阳 性结果 , 这不能完全作为诊断依据 , 只有当一定数量 的
17、病原体 存在时 才有 临床 意义。 FQ PCR 实 现了 PCR 从定性到定量的飞跃 , 有效解决 PCR 污染和对 模板定量不准确等问题。 3. 1 在动物病原菌检测和鉴定中的应用 炭疽杆菌作为人兽共患病的病 原 , 尤其炭疽杆 菌的芽胞可作为 生物武 器的 病原。王 梁燕等 在 100 L 纯化空气中加入炭疽杆菌芽孢 , 进行 F Q P CR 检测 , 1 h 内炭疽杆菌的单个芽孢就被检测到。空肠 弯曲菌是人类主要的食源性病原之一 , 常规细菌培 养鉴定结果不可靠。阳成波等 以 Lig ht Cycler 为 平台 , 先后建立一种基于 T aq Man 探针的 F Q P CR 和
18、SYBR G reen I, 能与双链 DN A 结合而发出荧光 的特性来定量检测空肠弯曲菌 , 检测限度为 5 cfu, 整 个检测过程在 60 m in 内完成。 3. 2 在动物病毒检测和鉴定上的应用 FQ PCR 问世后 , 积 累了大量有关 病原体核酸 量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料 , 形成感染性疾病的临床分子诊断标准。 FQ PCR 已 应用于许多病原体的检测 , 如对艾滋病病毒、乙型肝 炎病毒 DN A 、尖锐湿 疣皮损中 H PV D N A 、与 鼻咽癌关系密切的 EB 病毒、结核分支杆菌、巨细胞 病毒、 A 型和 B 型流 感病 毒 等病 原体 的检 测 。
19、 T akel e 等建立了高通量定性和定量检测来源于人或 猪的 P ER V 的 T aq Man 技术 ; 宋志军等 建立了猪 繁殖与呼吸综 合征病毒 ( PRR SV ) T aqM an 荧光定 量 RT P CR 检测方法 , 灵敏度可达 5. 0 拷贝 ; 张鹤晓 等建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒 ( N DV ) 的 T aq M an 荧光 RT P CR 方法 ; 黄娟等 建 立了 P RRSV 实时 PCR 检测患病猪的肺脏等样品 , 对 PRR SV 细胞培养物检测下限为 0. 01T CID50 ; 朱 文新等 建立了快速通用型 一步法 #检测活禽和禽 产品
20、中所有 A 型禽流感病毒的 FQ PCR 技术 ; 花群 兔化弱毒苗的 F Q P CR 技术 ; 罗长保等建立了 FQ PCR 检测口蹄疫病毒。 FQ PCR 用于动物传染病的 诊断 , 不但能定量检测病原体感染的强弱和在机体 内的分布 , 还具有灵敏、快速、省力的特点。 3. 3 在动物寄生虫检测和鉴定中的应用 常用 T aq M an 探针。如在 被感染猪和鼠组织、 全血、羊水以及脑脊髓液中的弓形虫定量 , 其检测极 限相当于 套式 PCR, 但准 确 率 大大 提高。德 国的 V on 等根据毛圆线虫某属 IT S2 基因序列建立了快 速、有效定量 的 T aqM an PCR 方法
21、, 并 能区分很多 重要牛、羊消化道寄生虫 ; 应用 T aq Man 探针从小牛 腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫 cp11 基因 和 16 S rRN A ; T anriverdi 等用 FQ PCR 对 2 个基因型 的小隐抱子虫 进行分型 , 结果优于 PCR RF LP 。刘世国等 采用 FQ PCR 动态观察感染 弓形虫的家兔血液中的虫体。 4 FQ P CR 在畜牧业中的应用 王群等 采用 T aq M an 探针检测鸡 干扰素。 朱燕等 采用 RT F Q P CR 证明中国黄牛背最长肌 中 capnl mRN A 表达量与宰后 3 d 的牛肉嫩度高度 相关。韩彩霞
22、等 建立 了绵羊 PrP 基 因 R T FQ PCR 检测方法。朱海等 所建立的 F Q P CR 对生 果蔬菜中的大肠埃希菌 O157 H 7 的检测 , 比传统 分离培养法更灵敏 , 可缩短试验时间 , 还发现脱脂奶 粉和 BSA 可 用 于 改 善 生 果 蔬 菜 中 大 肠 埃 希 菌 O157 H 7 的 F Q PCR 检测体系 , 提高检测率和检测 灵敏度。张明辉等 采用 T aq Man 和 SY BR G reen I 作探针 , 对大豆深加工产品中 RR 大豆的含量和 5 种未知大豆深加工样品检测 , 结果表明 , 两种方法均 可用于转基因深加工产品的检测。 5 FQ P
23、 CR 在其他方面的应用 5. 1 在动物检疫领域的应用 近年来 , 疯牛病、绵羊痒病已被证实与人的克雅 氏病有直接关系。 FQ PCR 可对动物源性 饲料、食 品或其他日 用品中牛羊源性成分的定量检测。国际 上严格禁用肉骨粉作所有牲畜的饲料用途 , 动物源 性食品、某些日用消费品的安全性也受到关注 , 其中 以检测 D N A 为基础的方法在应用中最为广泛 , FQ PCR 可使检测变的更加简便和精确。 5. 2 细胞因子表达定量检测 常用 F Q P CR 测定细胞因子 mR N A 表达情况 , 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 郭 杨等 : 荧光定量 P CR 技术及其应用
24、研究进展 检测及其临床意义 J . 医学临床研究 , 2003, 20( 8) : 81 569 571. 分析机体免疫状态。利用F Q P CR 测定鸡、猪在注 射疫苗、免疫增强剂以及在感染某种疾病情况下体 8 欧阳松应 , 杨 冬 . 实时荧光定量 PCR 技术及 其应用 J . 生 命 内细胞因子的 mR N A 表达水平。 5. 3 环境监测 应用 FQ PCR 对水资源及居家、办公环境中的 大肠埃希菌、藻青菌和一些寄生虫进行监测。赵传 鹏等 应用 F Q P CR 能有效检测反应 器中填料对 假单胞菌属类溶藻细菌的富集程度 , 定量假单胞菌 属在环境样本中的丰度 , F Q P CR
25、 还可定量研究微 生物结构组成及数量变化 , 深入探索微生物群落与 环境因子之间的相互作用及其动态变化过程 。 5. 4 转基因生物中的应用 用一个已知拷贝数的内源基因 作为参照 , 同时 对样品作 内源基因和外源基因的 F Q P CR。两者达 到荧 光阈值时的 Ct 值可 得到外源基因的 拷贝数 ; FQ PCR 还可用于转基因动物的纯合性鉴定及对转 基因后外源基因表达情况进行监测。 另外 , FQ PCR 还可用于基因转录的检测、基因 定型的研究 , 核苷酸定量、基因突变、染色体病的诊 断、药物疗效考核以及人类肿瘤早期发现及预后判 断的研究 。 6 小结 FQ PCR 技术特异性好 ,
26、准确性高 , 假 阳性低 ; 灵敏度高 , 可定量检测 , 误差小 ; 操作简单 , 自动化程 度高 , 产物的扩增和检测 闭管一步完成 , 交叉污染和 污染环境机会少 ; 无后处理 , 不需杂交、电泳、拍照。 但仍有些问题需解决 , 如自动化仪器试剂及其检 测的成本等。与 生物基 因芯片 技术结 合会使 FQ PCR 技术进一步完善 , 提高其在生命科学领域的应 用与普及。 参考文献 : 1 帅小蓉 , 夏庆友 . 定量 PCR 技术 的研究现状及 应用概述 J . 蚕 学通报 , 2002, 22( 4) : 20 28. 2 朱水芳 . 实时荧光聚合酶链式反应 检测技术 M . 北京 :
27、 中国 计 量出版社 , 2003: 33 49. 3 王梁燕 , 洪其华 . 实时定量 PCR 技术及其应用 J . 细胞生物 学 杂志 , 2004, 2( 2) : 62 67. 4 阳成波 , 蒋 原 . 基于 TaqM an 探针的 Real tim e PCR 定量检测 空肠弯曲杆菌 J . 动物医学进展 , 2003, 24( 1) : 74 78. 5 阳成波 , 蒋 原 . 应用 S YBR Green I 的 Real time 定 量检测 空 肠弯曲杆菌 J . 中国预防兽医学报 , 2003, 25( 3) : 183 188. 6 崔 琢 , 王淑民 . 实时荧光 定
28、量 PCR 检测乙 型肝炎病 毒 DNA 的临床应用价值 J . 蚌埠医学院学报 , 2004, 29( 1) : 67 68. 7 鲁建云 , 黄进华 , 陈 静 , 等 . 尖锐 湿疣 皮损中 H PVDNA 定 量 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 的化学 , 2004, 24( 1) : 74 76. Barletta J. Applications of real time immuno polymeras e chain r eaction( rt IPCR) for the rapid diagnos es
29、of viral antigens an d pathologic protein s J . Molecular Aspects of Medicine, 2006, 27 ( 2 3) : 224 253. 宋 志 军 , 宋 长 绪 , 杨 增 岐 , 等 . 猪 生 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 T aqMan 荧光定量 RT PCR 检测方法的建立 J . 中国兽医 科 学 , 2006, 36( 2) : 98 102. 黄 娟 , 姜 平 , 张常印 , 等 . 猪 繁殖与 呼吸综 合征病 毒实 时 PCR 检测方法的建立 J . 中国病毒学 , 2005, 20( 5)
30、: 530 533. 朱文斯 , 赖平安 , 黄茜华 , 等 . 荧光 RT PCR 快速检测禽流感 病 毒 H 5 亚型的研究 J . 中 国医药导刊 , 2003( 1) : 7 30. 花群义 , 徐自 忠 , 杨云庆 , 等 . TaqM an RT PCR 对水疱 性口炎 病毒的鉴定检测 J . 动物医学进展 , 2004, 5( 2) : 64 68. 邹 文 , 杨 旭 . S YBR Green 实时荧光定量聚合酶链反应 检 测鸭 乙型 肝炎 病 毒的 研究 J . 中国 肝脏 病杂 志 , 2004, 12 ( 7) : 444. Yang F L. Development
31、of quantitative real tim e polym erase chain reaction for duck eateritiz virus DNA J . Avian Disea ses, 2005, 49( 3) : 337 400. Higgin s J A, Fayer R, Trout J M, et al. Real tim e PCR for the detection of Cryp tosp oridium par v um J . J Microb iol Meth ods, 2001, 47( 3) : 323 337. 刘世国 , 秦 川 , 姚志军 ,
32、 等 . 弓形虫感染家 兔血液中虫体的 动 态观察 J . 中国人畜共患病学报 , 2006, 22( 2) : 759 760. 王 群 , 刘 光亮 , 童铁钢 , 等 . 鸡 干 扰素实 时荧光 定量 RT PCR 检侧方法 的建 立 J . 中 国兽 医科 学 , 2007, 37 ( 7) : 631 635. 朱 燕 , 罗 欣 , 徐增莲 , 等 . 中国黄牛 背最长 肌中 capnl mR NA 表达与嫩度的关系 J . 南京农业大学学报 , 2006, 29 ( 2) : 89 93. 韩彩霞 , 赵德明 , 吴长德 , 等 . 用实时荧光定量 RT PCR 方法 定 量绵羊
33、 Prp 基因的表达 J . 中国 农业大学 学报 , 2006( 2) : 61 64. 朱 海 , 杨 泽 , 李小燕 , 等 . 生果、蔬中大肠 杆菌 O157 H 7 荧 光定量 PCR 检 测 方 法的 评 估 及 改 进 J . 现 代 预 防 医 学 , 2006, 33( 8) : 1437 1439. 张 明辉 , 敖 金霞 , 曲 波 , 等 . 大 豆深加 工产品 两种 荧 光定 量 PCR 检测方法的比较研究 J . 生物技术 , 2006, 16 ( 2) : 56. 赵传鹏 . 实时荧光定量 PCR 法检 测环境假单胞菌 属细菌丰 度 J . 东南大学学报 : 自然
34、科学版 , 2006, 36( 1) : 143 146. 左丽丽 , 刘永军 . 荧光 定量 PCR 技术 在环境 微生物 检测中 的 应用 J . 西安航空技术高等专科学校学报 , 2008, 26(1) : 45. Neil J. Th e u se of real time PC R m ethods in DNA s equence variation an aly sis J . Clinica Ch imica Acta, 2006, 363: 32 47. M ikael K A, Jose M A, Martin B, et al. Th e r eal tim e poly
35、 meras e chain r eaction J . Molecular As pects of Medicine, 2006, 27: 95 125. 23 24 25 26 动物医学进展 , 2009, 30( 2) : 82 85 Pr ogress in V et erinary Medicine 流式细胞术在 活化 T 1, 2 1 淋巴细胞检测中的应用 1* 1 1 胡茂志 ,孟 闯 , 潘志明 , 焦新安 , 刘秀梵 摘 ( 1. 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室 , 江苏扬州 225009; 2. 扬州大学江苏省物质微区与性能测试服务中心 , 江苏扬州 225009)
36、要 : 免疫细胞的活化和增殖是免疫应答产生的一种标志 。 静止 T 淋巴细胞经过抗原刺激活化后 , 表现出一系列的特征 , 如细胞膜表面活化分子的表达 、 细胞分裂和产生细 胞因子等 。 近年来 , 已有利用流式 细胞术 ( F CM) 通过检测免疫细胞活化后的特性 , 来分析抗原特异性免疫应答及其应答规律的报道 。 论文分 别从几个不同的角度综述了 F CM 在活化 T 淋巴细胞检测中的应用 。 关键词 : T 淋巴细胞 ; 活化 ; 流式细胞术 中图分类号 : S852. 4; S854. 4 文献标识 码 : A 文章编号 : 1007 5038( 2009) 01 0082 04 特定
37、免疫细胞经过抗原刺激活化以后 , 会发生 期 ) 、 H L A D R ( 较 晚 期 ) 以 及 黏附 分 子 CD 62L 5 8 和 一系列的变化 , 如表达表面活化分子、产生特定细胞 3 CD 44 等 。 CD69 是一种 %型膜糖蛋白。近期研 因子、细胞增殖分裂以及细胞凋亡等。 H 胸苷 DN A 渗入法等体外 检测方法是评 价免疫功能的 常用方 法 。但是 , 这些方法不能针对单个细胞。目前 , 流 式细胞术 ( f low cy to metr y, F CM ) 可以在单 细胞水 平上进行多参数检测 , 如细胞 DN A 合成、表面抗原 分子和胞内因子的表达 , 并且可以追
38、踪特定细胞在 免疫应答过程中的作用 。本文就 F CM 在检测 抗 原特异性免疫应答中的应用做一综述。 1 T 淋巴细胞膜表面 活化分子的表达 T 淋巴细胞在活化过程中 , 会表达一些特殊的 分子 , 如 CD 69 ( 较 早期 ) 、 CD71 ( 早 期 ) 、 CD25 ( 晚 收稿日期 : 2008 10 30 究表明 , CD69 分子是一种细胞活化后的免疫调节分 子 。细胞受到刺激后 ( 2 h 3 h) , 除了红细胞外 , 所有骨髓来源的细胞 ( 如淋巴细胞、单核细胞、肥大 细胞以及中性粒细胞等 ) 即会明显表达 CD 69 分子。 用 PH A P 刺激后 , 3 h 12
39、 h 内 CD69 分子的表达 量持续上升 , 24 h 后 开始下降。 CD 69 表达峰值的 出现时间早于 CD71、 CD 25 和 H LA DR 分子。由于 没有合适的体内模型来研究其生理功能 , CD69 分子 的免疫功能尚未详细阐明 。 CD71 分子是与 T 细胞 受 体 ( T CR ) 链 非 共 价 结 合 的 转 铁 蛋 白 , 在信号转导 过程中 起重要 作用。静息态 细胞表 达 基金项目 :江苏省自然科学基金青年科 技创新人才项目 ( BK2007511) ; 江苏 省高校自然科学基础研究项目 ( 07K JB230136) 作者简介 : 胡茂志 ( 1976- )
40、 , 男 , 山东临沂人 , 助理研究员 , 硕士 , 主要从事微生物学与免疫学研究 。 * 通讯作者 Advance i n Fluorescent Quantitative PCR and Its Applications G U O Y ang , CH EN Shi jie , G U O Wan zhu , L I Jing ( 1. S ichuan E xp ort and Imp ort I nsp ection Quarantine Bure au, Chen gd u, Sichuan, 610041, China; 2. A nimal Biological Te chn
41、ology Ce nter of S ichuan A gr icu ltur al Univ er sity , Yaan , S ichuan, 625014, China; 3. Mater ial and Biote chnology Colle ge , Che ngd u Univ e rsity of T echnolog y , Ch eng du, S ich uan, 610059, China) Abstract: Fluorescent quant it at iv e PCR is a lat ely developed new t echnolo gy t hat
42、is used t o det ect specific nucleic acids in real t ime. It is an ingenio us combinat ion of f luo rescent pro bes, f luo rescence resonance en erg y t ransf er ( F RET ) technolog y and P CR. H ow ever, f luor escent probes ar e t he m ost import ant part of them . F luorescent quant it ative PCR
43、has t he characteristics of st rong specificit y , high sensit ivit y, fine re petit iveness and accurat eness, f ast and t ot al ly closed ract ion, it has ref ormed the conv ent ional PCR as w ell as enlarged applicatio n. T his art icle review ed t he pr inciple, detection sy st em s f or quant ificat ion and some applications of t his new t echnique. Key words: fluorescent quant it at ive PCR; fluorescent pro bes; monito r; applicat ion 1 2 4 9 10 12 1, 2 1 2 3