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1、外源基因的表达基因表达技术是基因工程的核心技术之一外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个环节，它是在一系列酶蛋白和调控序列的共同作用下完成的原核生物基因表达系统酵母基因表达系统植物基因表达系统动物基因表达系统第一节 基因表达机理1外源基因的起始转录转录起始的速率是基因表达的限速步骤.选择可调控的启动子和相关的调控序列.启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后开始高效表达 原核生物基因表达的启动子一般比较简单，可分为两大类：诱导型启动子和组成型启动子，前者如lac、trp、PR、PL、tac等的启动子，后者如T7噬菌体的启动子外源基因在真核生物中的起始转录和表达
2、相对复杂，启动子和增强子序列是外源基因在真核细胞中表达所必需的真核生物基因表达的启动子也可分为诱导型和组成型等类型.2 mRNA2 mRNA的延伸与稳定性的延伸与稳定性1) mRNA的延伸 v 衰减子位点（attenuators）：类似于简单的终止子，在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间在构建表达载体时要尽量避免该序列的存在v 抗终止的序列元件（antitermination）v Poly(A)掺入信号序列：AAUAAA2) mRNA的稳定性 mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少对原核细胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失的受体菌对真核细胞来说，则需要考虑增加mRNA
3、的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性3 3 外源基因外源基因mRNAmRNA的有效翻译的有效翻译1)原核生物外源基因mRNA有效翻译基本原则 * AUG（ATG）是首选的起始密码子 * SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的的4个碱基 * SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基 * 在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构2)真核生物基因mRNA有效翻译 非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列都含有共同的序列5 -CCA（G）CCATGG- 3，如果改变这一序列，可使翻译的起始效率大大降低4 4 表达蛋白在细胞中的稳定性表
4、达蛋白在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素蛋白质水解是一个有选择的、精细调控的过程，它会影响外源基因表达产物在细胞中的积累 构建融合蛋白表达系统 构建分泌蛋白表达系统 构建包涵体表达系统 选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统5 5 目的基因沉默目的基因沉默 基因沉默（gene silencing）是导致外源基因不能正常表达的重要因素位置效应基因沉默：基因在基因组中的位置对其表达的影响在植物和动物转基因中，外源基因进入细胞核中并整合到染色体DNA上，其整合的位点与基因的表达密切相关转录水平的基因沉默：在DNA水平上的基因
5、调控，主要是由于启动子的甲基化或外源基因的异染色质化而引起的转录后水平的基因沉默：在RNA水平上的基因调控，比转录水平的基因沉默更普遍共抑制(cosuppression)是转录后水平的基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制第二节 基因表达的调控元件1 启动子 启动子（promoter）是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游其长度因生物的种类而异，一般不超过200bp一旦RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上，即可启动转录启动子是基因表达调控的重要顺式元件 启动子特性序列特异性在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的序列框，序列
6、框中碱基的变化会导致转录启动的滞后和转录速度的减慢方向性启动子是一种有方向性的顺式调控元件，在正反两种方向中只有一种具有启动功能位置特性启动子只能位于所启动转录基因的上游或基因内的前端，处于基因的下游或在基因的上游但离所要启动的基因太远，一般都不会起作用种属特异性原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动子原核生物启动子转录起始位点。多数细菌启动子转录起始区序列为CATPribnow框。在距转录起始位点上游6bp处存在一个六联体保守序列：TATAAT，由于中间的碱基位于转录的起始点上游的10bp处，又称为-10序列区。少数Pribnow框中间碱基的位置在-9-18之间变化。S
7、extama框。在转录启动区的另一个六联体保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称为-35区，该保守序列为TTGACA，它是RNA聚合酶的识别位点。间隔区。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重要。但间隔序列的长度却是影响启动子功能 真核生物启动子I型启动子。I型启动子所属基因编码的产物为rRNA 前体，经剪切加工后成为各种成熟的rRNA分子。型启动子。型启动子所属的基因绝大多数为编 码蛋白质。 * 启动子基本区:转录起始点及邻近的TATA框。 * 启动子辅助区由多个位置不定保守序列组成 * GC框:起始位点上游-100-300位置GGGCGG序列型启动子
8、。 * 内启动子:转录起始位点的下游，如tRNA和5sRNA 的启动子。 * 外启动子:转录起始位点的上游，如脊椎动物U6 核小RNA和7SK RNA启动子，其结构类似于真核生 物型启动子。 原核生物基因RNA转录的起始2 增强子增强子（enhancer）是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列增强子的结构类似于启动子，由多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合转录调控区通常含有多个自主的增强子，每个长501500bp不等每个增强子都有一种特定的功能 增强子的一般特性双向性增强子的正反两个方向都有调节活性重复序列增强子是一类相对较大的调控元件，一般都含有能独立行使功能的重复序
9、列增强子行使功能与所处的位置无关增强子可处于转录起始位点的上游、下游，甚至处在转录序列之中它们离被调控的序列可达数千个碱基对特异性少数增强子（如SV40增强子）能在所有类型的细胞中发挥作用，而大多数增强子行使功能时具有组织特异性，或在给定细胞的特定阶段发挥作用增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能3 终止子终止子（terminator）的功能不同于启动子和增强子，但它对基因的正常表达有重要意义转录启动后，RNA酶沿DNA链移动，持续合成RNA链，直到遇到转录终止信号 本征终止子：不需要其它蛋白辅助因子便可在特殊的 RNA结构区内实现终止作用依赖终止信号的终止子 则要依赖
10、专一的蛋白质辅助因子（如因子）即 发夹结构和由6个U组成的尾部结构，两者均为转录 终止所必需 依赖型终止子：在在终止位点上游5090bp区域具有一种普遍的结构特征，即合成的RNA链含有丰富的C碱 基，但G碱基的含量很低，该区域也是因子识别位点 4 衰减子 衰减子（attenuator）：基因表达调控的精细调节装置，它利用了原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因转录进行开关式的微调作用，从而保证原核生物在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个基底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等 5 绝缘子* 绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中，既是基因表
11、达的调控元件，也是一种边界元件在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子，它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用* 果蝇中绝缘子SCS和SCS分别位于果蝇多线染色体87A7座位hsp70基因两侧的核酸酶高度敏感区，它们是一种具有顺式调控作用的边界元件，能使其界定的染色体结构域上的基因免受区域外两端正调控和负调控信号的影响6 反义子 反义RNA（antisense RNA）是一类与特定DNA序列互补的小分子RNA编码反义RNA的DNA称为反义子反义RNA广泛存在于原核生物和真核生物中，它在DNA复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起着调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍反义
12、RNA的调控作用反义RNA可以通过直接抑制和间接抑制两种方式调节DNA的复制反义RNA与引物RNA前体互补，使引物RNA无法与DNA模板结合，进而抑制DNA复制的频率另一方面，反义RNA还可通过阻断复制激活蛋白因子的合成而间接抑制DNA的复制在转录水平上，反义RNA对基因表达的调控是多形式的反义RNA可通过与mRNA的5端互补结合而阻止转录的延伸；或作用于mRNA的polyA区域，抑制mRNA的成熟及其运输；或与真核生物mRNA结合影响其剪切和加工反义RNA对mRNA翻译的调控主要有两种方式：通过与mRNA的5端SD序列结合；或通过与mRNA的5端编码区（如起始密码）结合，直接抑制翻译的起始第
13、三节 基因表达系统* 基因克隆的最终目的是实现目的基因在受体细胞中的表达根据表达系统的受体细胞的不同，可分为四类：原核生物表达系统，酵母表达系统，植物表达系统和动物表达系统.* 目前利用的表达系统主要为原核生物表达系统和酵母表达系统1 原核生物表达系统1.1大肠杆菌表达系统1）外源基因在大肠杆菌中高效表达的要素 a）强启动子：决定转录启动的频率 b）强终止子：决定转录产物的均一性 c）SD序列：决定mRNA的翻译起始效率 d）密码子：不同生物体的基因对简并密码子 的选择具有偏爱 e）质粒的拷贝数：mRNA的含量2）大肠杆菌表达系统构建的策略外源基因在大肠杆菌中的高表达会造成异源蛋白在细胞内大量
14、积累，而异源蛋白易被细胞内的酶所降解其主要原因是：* 大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性 和翻译后加工系统* 不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构及众多 基因表达产物的稳定因子* 高效表达的异源重组蛋白在细胞内形成高浓度 微环境，增强蛋白分子相互作用A）构建表达包涵体型异源蛋白 包涵体包涵体：某种生物大分子（蛋白质）在细胞中累积，致密地积聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露的结构 结构特点：具有正确的氨基酸序列，但空间结构是错误的 优点：简化了外源基因表达产物的分离纯化程序包涵体密度大，水溶性低影响包含体形成的因素影响包含体形成的因素* 温度：较低培养温度有利于形成包含体* 表达水平：过量表达
15、有利于形成包含体* 细菌遗传性状：大肠杆菌染色体上与热休克 蛋白有关的基因失活有利于形成包含体* 异源蛋白质的氨基酸序列：突变体比天然蛋 白更易形成包含体B）构建重组异源蛋白表达系统 将SD序列和启动子安装在外源基因的5端ATG碱基前的正确位置，使外源基因高效表达序列正确的天然蛋白C）构建分泌型异源蛋白表达系统 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直接进入到培养基中 优点：增大表达蛋白的稳定性大大简化后续的分离纯化步骤D）构建融合型异源蛋白表达系统 异源蛋白与受体细胞自身蛋白以融合形式共表达 特点：受体菌蛋白与异源蛋白形成良好的杂合构象，使得多肽链上的
16、蛋白酶切位点隐藏在蛋白分子内部而不易被切割，因而大大增加了产物的稳定性E）构建寡聚型异源蛋白表达系统 通过外源基因多分子线性重组增加目的基因的拷贝数 多表达单元型重组多表达单元型重组：外源基因均携带各自的启动子、终止子、SD序列及起始和终止密码翻译起始信号，各单元方向可正可反 多顺反子型重组多顺反子型重组：外源基因含有各自的SD序列以及翻译和终止信号，将它们串联起来后克隆在一共同的转录启动子下游，并安上一个共同的转录终止子 多编码序列型重组多编码序列型重组：多个外源基因序列串联在一起，使用一套转录调控元件3) 大肠杆菌中高效表达目的基因的策略优化表达载体设计替换外源基因中的稀有密码子提高外源m
17、RNA的稳定性提高基因表达产物的稳定性优化发酵过程1.2 芽孢杆菌重组表达系统芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，其作为外源基因表达系统具有如下优点： * 能将表达产物分泌到培养基中，且在多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经芽孢杆菌分泌后，具有天然构象和生物活性 * 在传统发酵工业中广泛应用，无致病性 * 芽孢杆菌的遗传背景清楚，生长快，培养条件简单1.3 蓝藻基因表达系统1)蓝藻表达系统的特点基因组简单，遗传背景简单细胞壁为G-，主要由肽聚糖组成光能自养生长，培养条件简单含有多种内源质粒，便于构建表达载体富含营养物质（蛋白质，维生素）2) 蓝藻表达载体 复制子：含有在大肠杆菌中起始复制的序列 和蓝藻中复
18、制起始序列 启动子：可调控的启动子 * 细菌基因表达启动子(nos) * 嗜菌体基因表达启动子（PL,PR) * 金属硫蛋白基因启动子 * 热休克蛋白基因启动子 * 光诱导表达启动子 选择标记基因3)蓝藻细胞中高效表达外源基因提高外源基因在蓝藻中的拷贝数组装含强启动子的外源基因表达盒以多种形式表达外源基因产物2. 酵母基因表达系统酵母菌是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是理想的真核生物表达系统，具有以下特点： * 基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单. * 具备真核生物蛋白翻译后修饰加工系统. * 不含特异性病毒，不产生毒素，安全. * 大规模发酵简单，成本低廉. * 能将外源
19、基因表达的产物分泌到培养基中.1) 酵母基因表达载体酵母基因表达载体由酵母野生型质粒，原核生物质粒载体和酵母染色体的功能基因共同组成DNA复制起始区：包括大肠杆菌中起始复制序列和酵母菌中起始复制的序列（2质粒复制起始序列，酵母基因组中自主复制序列）选择标记基因：营养缺陷型选择标记和显性选择标记（遗传霉素G418,放线酮）.有丝分裂稳定区：来源于酵母染色体着丝粒片断表达盒：由启动子，分泌信号序列（1730AA)，终止子等组成组成：* II型RNA聚合酶启动子 * 杂合启动子：从已有的启动子中构建类型：* 温度调控型启动子 * 超诱导型启动子：加入诱导物时启动子活性成 百上千倍地增加 * 严谨控制
20、型启动子：启动子受某种因素的调 节，使其表达控制在一定的水平上酵母菌启动子2) 酵母基因表达载体的类型自主复制型质粒载体：能够在酵母细胞中进行自我复制，但传代过程中易于丢失整合型质粒载体：质粒不含酵母DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，含有整合双臂着丝粒型质粒载体：含有自主复制序列和酵母染色体有丝分裂稳定序列元件，能保持质粒在细胞中稳定性酵母人工染色体：含有酵母染色体自主复制序列，着丝粒序列，端粒序列，酵母选择标记基因等，在细胞分裂过程中保持稳定性3）常用酵母菌表达系统A）酿酒酵母表达系统(Saccharomyces cerevisiae).B）乳酸克鲁维酵母表达系统(Kluyvero
21、myces lactis).C）巴斯德毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)D）多型汉逊酵母表达系统(Hansenula polymorpha)4) 酵母中高效表达外源基因的策略 优化表达载体的设计 选择合适的酵母受体系统 提高外源基因在细胞中的拷贝数 提高外源基因转录水平和在细胞中的稳定性3.植物基因表达系统对基因结构的认识主要来自于原核生物，但真核生物基因与原核生物基因之间的结构和表达调控存在很大差异它包括转录前调控、转录水平调控、转录后加工调控、转运调控和翻译调控。分子水平：真核生物基因组含量大，基因非连续， 高度重复，碱基与氨基酸对应的密码间存在差异细胞水平：转录和翻译发生
22、的时间和空间是相对独 立的，转录和翻译后存在复杂加工过程个体水平：复杂的多细胞有机体，分化发育,存在不 同程度的内稳态1）植物基因表达载体系统（Ti质粒）启动子：组成型启动子：基因表达水平基本恒定在一定水平，在不同组织部位没有明显差异如CaMV 35S启动子组织特异性启动子：基因表达在特定的组织或器官，并表现出发育调节的特性如花粉特异表达基因启动子（lat52).诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号刺激下可大幅度提高基因的转录水平如光诱导启动子，热诱导启动子，创伤诱导启动子终止子：不同来源终止子决定外源基因的转录活性和 转录产物的稳定性T-DNA序列：是实现外源DNA与染色体DNA整合的功
23、能单位选择标记基因：通常为编码正常植物中不存在的酶，并可与外源基因构成嵌合基因，能在转化体中有效表达且易于检测和分析如二氢叶酸还原酶基因(DHFR),潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)，Gus基因等2）克隆化基因在植物细胞中的表达调控启动子的调控终止子的转录调控激素对克隆化基因的调控3） 克隆化基因的瞬时表达与稳定表达 克隆化基因的瞬时表达：在合适的条件下，转化的外源基因在数小时后就能检测到其表达产物，在1-2d内达到最高值，随后又逐渐降低，至十多天后完全消失 * 原理：未整合的外源基因以游离质粒状态表达或植物本身的调控作用使表达降低 克隆化基因的稳定表达：克隆化基因整合到核基因组DNA上，并能稳
24、定遗传和表达外源基因4) 外源基因在植物细胞内高效表达构建高效表达载体：选择合适的启动子，组入完整的基因表达调控序列，合理插入内含子，优化先导序列提高翻译效率正确利用增强子：多数植物的增强子具有组织特异性防止外源基因失活4克隆化基因在哺乳动物细胞中的表达1)基因表达载体系统 不带真核复制子的质粒型载体如pTK2，克隆化基 因整合到基因组中，在基因组的调控下低水平表达 带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体(SV40衍生 载体）复制子：病毒基因组复制子启动子：包括核心启动子和上游启动子，如病毒SV40基因转录启动子和某些真核基因启动子终止信号和加poly(A)信号剪接信号：选择标记基因：胸苷激酶(
25、tk)，二氢叶酸还原酶(DHFR)等.2) 转基因的动物受体细胞系统 * 选择来源丰富的起始受体细胞 * 建立动物细胞特异性选择标记3）动物转基因的表达特性* 转基因的时空表达特性 在动物的发育过程中，相关基因的表达表现 为严格的时序特异性和组织特异性* 转基因的可控性表达 可以通过一种或几种因子诱导基因的表达， 其诱导条件受受体细胞的性质和启动子的 类型决定* 转基因的共抑制特性 染色体含有外源基因的同源基因时，两者表 达同受抑制第四节 表达产物的检测与纯化1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 克隆化基因通过诱导表达后，破碎细胞提取总蛋白，然后电泳并进行对比分析2、免疫学检测-免疫沉淀法具有较
26、好的选择性，可应用于蛋白质混合物中靶抗原的定性与定量检测1）靶蛋白的放射性标记 以发射弱射线半衰期为87天的35S标记 的甲硫氨酸和半光氨酸掺入到蛋白质中2）裂解细胞 使所有的靶抗原呈溶解状态，并保留其 免疫反应性质不被降解3）形成特异性免疫复合物 将抗靶蛋白的特异性加入到一定量的细胞 裂解物中，形成抗原-抗体复合物4）收集并纯化免疫复合物5）分析免疫沉淀中放射性标记的蛋白3 Western 印迹法 1）SDS-PAGE 2）电转移 凝胶电泳后，将蛋白质转移到固相支持物 3）染色 * 丽春红S-染色法：与免疫学检测法兼容， 短时显色，可被洗去，不影响后面显色 * 印度墨迹显色：放射性标记抗体探针4）封闭膜上与免疫球蛋白结合位点5）印迹膜的检测 （a）用抗靶蛋白的第一抗体与硝酸纤维素膜共 温育 （b）用二级免疫试剂与硝酸纤维素膜温育 （c）酶联抗体底物生色4 生物学活性检测某些表达产物为酶或反应底物时，可直接加入反应底物或酶，检测反应的活性5 表达产物的分离纯化1）大量样品的制备2）柱层析3）电泳纯化4）抗原或活性检测