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1、动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备细胞核移植细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程技术技术动物细胞工程的动物细胞工程的基础基础（一）、概念（一）、概念 是指从动物机体内取出是指从动物机体内取出相关相关的组织，的组织，将它分散成将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在，然后放在适宜的适宜的培养基中，让这些细胞培养基中，让这些细胞生长生长和和增殖增殖。（二）、原理（二）、原理细胞分裂增殖细胞分裂增殖（三）、过程（三）、过程幼龄动物幼龄动物剪碎组织剪碎组织原代细胞培养原代细胞培养取动物器官取动物器官和组织和组织细胞悬浮液细胞悬浮液传代细胞培养传代细胞培养胰蛋白酶处理
2、胰蛋白酶处理单个细胞单个细胞胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理单个细胞单个细胞细胞贴壁细胞贴壁:培养贴附性细胞时,细胞要能贴附于底物上才能生长繁殖.细胞接触抑制细胞接触抑制 细胞在贴壁细胞在贴壁生长过程中，随生长过程中，随着细胞分裂，数着细胞分裂，数量不断增加，最量不断增加，最后形成一个单层，后形成一个单层，此时细胞间相互此时细胞间相互接触，细胞分裂接触，细胞分裂和生长停止，数和生长停止，数量不再增加。量不再增加。有关概念有关概念v原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般培养的第为原代细胞。一般培养的第1 1代细胞与传代细胞与传1010代以内的细胞称为原代细
3、胞培养。代以内的细胞称为原代细胞培养。v传代培养传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。归纳归纳过程过程取取 的组织、器官的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 贴满瓶壁的细胞贴满瓶壁的细胞单个细胞单个细胞加入加入 液液动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物物胰蛋白胰蛋白培养培养接触抑制接触抑制原代原代 培养培养( (分装前分装前) )1-10代细胞代细胞遗传物质遗传物质 改变改变原代细胞原代细胞培养培养加加 液液4050代细胞代细胞
4、(细胞株细胞株)未未遗传物质遗传物质 改变改变无限传代（无限传代（细胞系细胞系）已已传代传代培养培养胰蛋白胰蛋白 酶酶 有关概念有关概念细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条件下可以无限制传
5、代，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。思考题：思考题：1 1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？做动物细胞培养材料？2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和成块组织
6、使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。培养。3、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？的物质是什么成份？催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质白质( (胶原蛋白等胶原蛋白等) )。4、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能能6 6、既然、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉胰蛋白酶能将细胞消化掉，那，那将动物将动物组织分散成单个细胞
7、要组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？注意什么问题呢？7 7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间的控制注意时间的控制 不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适PHPH不同，而正常组织不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PHPH较接近较接近1 1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 保证细胞保证细胞顺利的生顺利的生长增殖长增殖 添加一定量的抗生素，定期更换培养液添加一定量的抗生素，定期更换培养液添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、无添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清等。机
8、盐、微量元素、动物血清等。（四）、动物细胞培养的条件（四）、动物细胞培养的条件2 2、营养、营养3 3、温度和、温度和PHPH 培养室中控制培养室中控制, ,使之达到使之达到36.5 36.5 0.5, 7.27.4 0.5, 7.27.4培养箱中提供培养箱中提供O O2 2和和COCO2 2（95%95%空气和空气和5% CO5% CO2 2 ）4 4、气体环境、气体环境：植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的细胞的 细胞细胞培养基特有培养基特有成分成分 、植物激素、植物激素 葡萄糖、葡萄
9、糖、 培养结果培养结果植物体植物体培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得获得全能性全能性增殖增殖蔗糖蔗糖动物动物血清血清细胞株、细胞系细胞株、细胞系细胞细胞, ,某些某些蛋白质蛋白质（五）、动物细胞培养技术的应用（五）、动物细胞培养技术的应用（3）细胞的生理、药理、病理研究）细胞的生理、药理、病理研究 （1） 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植（2） 基因工程的受体细胞基因工程的受体细胞资料一：资料一： 培养的动物细胞可以用于培养的动物细胞可以用于检测有毒物质检测有毒物质。许。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发多致畸、致癌物
10、质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手段。而灵敏的有效手段。 资料二：资料二：人工关节人工关节软骨再生软骨再生1.1.第一次手第一次手术术: : 从从病人病人关节软骨关节软骨中未中未 受力的部分，取出一片受力的部分，取出一片约为约为葡萄葡萄干干大大小的健康小的健康软软骨骨组织组织。2.2.分分离软离软骨骨细胞并经细胞并经三星期的三星期的体
11、体外外 培培养养，使，使细胞数细胞数增加增加约约10102020倍。倍。3.3.第二次手第二次手术术: : 清理清理软软骨受骨受损损的部分，的部分，从从下方骨下方骨头头部位取出一片部位取出一片约与伤约与伤口口大大小相同的骨膜，小相同的骨膜，缝缝在在伤伤口上方，再口上方，再将将软软骨骨细胞细胞注射到骨膜下方。注射到骨膜下方。资料三：资料三：结果结果: : 经过复健经过复健一年一年后后即可即可恢复恢复正常的生活。正常的生活。（一）、动物细胞核移植的概念：（一）、动物细胞核移植的概念： 动物核移植是将动物的一个细胞的动物核移植是将动物的一个细胞的细胞细胞核核, ,移入一个已经去移入一个已经去掉细胞核
12、的卵母细胞掉细胞核的卵母细胞中中. .使其重组并发育成一个新的胚胎使其重组并发育成一个新的胚胎, ,这个这个新的胚胎最终发育为动物个体新的胚胎最终发育为动物个体. .克隆动物：用核移植的方法得到的动物。克隆动物：用核移植的方法得到的动物。动物核移植动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体这个新的胚胎最终发育为动物个体（二）、分类：（二）、分类：胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植：体细胞核移植体细胞核移植：细胞分化程度低，
13、恢复细胞分化程度低，恢复全能性容易全能性容易 细胞分化程度高，恢复细胞分化程度高，恢复全能性困难全能性困难克隆动物克隆动物:用核移植方法得到的动物用核移植方法得到的动物.克隆克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的传上均一的生物生物群，即具有完全相同的遗传组成群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。的意思，用以指无性增殖物。 去核去核卵细卵细胞胞供体供体细胞细胞电刺激使电刺激使两细胞融两细胞融合合重组细胞重组细胞重组胚胎重组胚胎新个体新
14、个体代孕母牛代孕母牛C胚胎移植胚胎移植卵细卵细胞培胞培养养无性生殖无性生殖（三）、体细胞的核移植过程（三）、体细胞的核移植过程高产奶牛高产奶牛A供体供体细胞细胞培养培养供卵奶牛供卵奶牛B（四）、体细胞核移植技术的应用前景（四）、体细胞核移植技术的应用前景 1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种、保护濒危物种3、生产医用蛋白质、生产医用蛋白质及组织器官的移植的及组织器官的移植的供体供体（五）、体细胞核移植技术存在的问题（五）、体细胞核移植技术存在的问题 1、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚。、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚。2、克
15、隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、易出、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、易出 现早衰等问题。现早衰等问题。3、生产克隆动物费用昂贵。、生产克隆动物费用昂贵。 2 2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是细胞是 （ ） A A获得不死性的细胞获得不死性的细胞 B B1010代以内细胞代以内细胞 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞1 1、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是 （ ） A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养A AD D课堂反
16、馈练习课堂反馈练习3 3、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（ ）A A、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞 分泌蛋白分泌蛋白B B、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散C C、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡 过程中过程中D D、培养至、培养至5050代后传代细胞遗传物质没有发生改变代后传代细胞遗传物质没有发生改变B B4 4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（
17、）无毒的环境无毒的环境 无菌的环境无菌的环境 培养基需要加入血培养基需要加入血清清 温度与动物体温相似温度与动物体温相似 需要需要O O2 2，不需要，不需要COCO2 2 COCO2 2能调节培养液能调节培养液PHPHA A、 B B、 C C、 D D、 D D5 5、动物细胞培养的特点、动物细胞培养的特点 （ ）细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 细胞分化细胞分化 接触抑制接触抑制 减数分裂减数分裂 原代培养一般传原代培养一般传1 11010代代A A、 B B、C C、 D D、A A6 6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：此回
18、答：（1 1）容器）容器A A中放置的是动物器官或组织。它一中放置的是动物器官或组织。它一般取自般取自_。（2 2）容器）容器A A中的动物器官或组织首先要进行的中的动物器官或组织首先要进行的处理是处理是 ，然后用，然后用 酶处理，酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是是 。动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物物剪碎剪碎胰蛋白胰蛋白使细胞与培养液充分接触，便于培养使细胞与培养液充分接触，便于培养（3 3）培养首先在）培养首先在B B瓶中进行，瓶中的培养基成瓶中进行，瓶中的培养基成分有分有 _等。在此瓶中培养等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡
19、，这是培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第到第 代，到这时的培养称为代，到这时的培养称为_ _ 。（4 4）为了把）为了把B B瓶中的细胞分装到瓶中的细胞分装到C C瓶中，用瓶中，用 处理，然后配置成处理，然后配置成 ，再，再分装。分装。 动物血清动物血清10原代培养原代培养胰蛋白酶胰蛋白酶细胞悬浮液细胞悬浮液动物动物细胞细胞融合融合细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核细胞融合与融合诱导细胞融合物质细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：
20、病毒、聚乙二醇诱导剂：病毒、聚乙二醇诱导细胞融合的病毒必须灭活。诱导细胞融合的病毒必须灭活。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？病毒需要灭活？二、单克隆抗体二、单克隆抗体什么是抗体？什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。淋巴细胞产生抗体。单克隆抗体单克隆抗体 由单个由单个B淋巴细胞经过无性繁殖淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所
21、产生的化学性质单一、特这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点特点：特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高异
22、性强，灵敏度高。应用主要有：应用主要有：1、临床诊断、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿治疗肿瘤瘤植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、 细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体