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1、植物细胞工程HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究ResearchonCallusInductionandPlantRegenerationofTobaccoLeaves姓名:黄金波CANDIDATE：Huang-JinBo学号:2021304200510STUDENTID：2021304200510课程:植物细胞工程实验CURRICULUM：PlantCellEngineeringExperiment班级:MAJOR:生技1201班Biotechnology1201指导教师：SUPERVISOR：柳俊齐迎春陈浩Liu-JunQi-Yi
2、ngChunChen-Hao中国武汉WUHAN，CHINA烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究黄金波华中农业大学生命科学技术学院生技1201班摘要目的以烟草叶片为材料，通过这次实验，基本把握植物愈伤组织诱导与植株再生的原理和方法，熟练把握相关实验操作技术；另外，通过本次实验，完成烟草植株再生，并比照光照和黑暗等不同方法，对诱导愈伤组织状态和诱导率的影响，进行结果分析。方法在无菌条件下，把烟草叶片剪成1cm2大小的小方块，先通过含0.25mg/LNAA和0.25mg/LBA的MS诱导培养基在光照和黑暗条件下诱导培养；三周后，转接到含0.25mg/LNAA和1.0mg/LBA的MS分化培养基中光照
3、培养；两个月后，观察结果，统计分析。结果诱导培养后，在光照条件下和在黑暗条件下培养的均有67.7%的被污染了；用剩下的33.3%全部接种到分化培养基上培养。结果表明分化率在光照条件下和在黑暗条件下无差异；每个愈伤组织分化芽数在光照条件下明显多于在黑暗条件下诱导；分化芽状态在黑暗和光照条件有一定的区别，分化植株苗在光照和黑暗条件下诱导没有明显区别。结论光照条件和在黑暗条件下诱导能够影响愈伤分化芽数和分化芽状态。关键词烟草叶片；愈伤组织；细胞工程；分化；诱导；植株再生ResearchonCallusInductionandPlantRegenerationofTobaccoLeavesHuang-
4、JinBoHuazhongAgricultureUniversity,CollegeofLifeScienceandTechnology,Biotechnology1201AbstractObjectiveUsingtobaccoleavesasmaterials,throughtheexperiment,weshouldhandlethebasicprincipleandmethodofplantcallusinductionandplantregeneration，masterrelatedexperimentstechnology;Inaddition,throughthisexperi
5、ment,tocompletethetobaccoplantregeneration,andcompareddifferentmethodsofcallusinduction,suchaslightanddarkstate,andtheeffectstothestateandinductionrate,thenanalyzingtheresults.MethodThetobaccoleafwascutinto1cm2sizesmallsquaresunderasepticconditions.FirstlyinducedintheMSinductionmediumwith0.25mg/LNAA
6、and0.25mg/LBA,undertheconditionoflightanddark,respectively;Threeweekslater,transferredtoMSdifferentiationmediumwith0.25mg/LNAAand1.0mg/LBAculturingunderlight;Twomonthslater,observingtheresults,andanalyzingthestatistics.ResultsAftertheinductionculturing,67.7%materialswerepollutedbothunderthecondition
7、oflightanddark;rest33.3%materialswereinoculatedtothedifferentiationmedium,continuingtocultivate.Asaresult,itwassuccessfully.Theresultsshowthattherearenoobviousdifferencesbetweenwiththelightconditionanddarkcondition.Eachnumberofcallusbuddifferentiationundertheconditionofthelightinducedsignificantlymo
8、rethaninthedarkcondition;Buddifferentiationstatushavecertaindifferenceindarkandlightconditions,differentiationofplantseedlingsininducedtherewasnosignificantdifferencebetweenlightanddarkconditions.Conclusiontheilluminationconditionandundertheconditionofdarkinductioncanaffectthebuddifferentiationofcal
9、lusbudnumberandstatus.KeyWordsTobaccoLeaves；Callus；CellEngineeringDifferentiation；Induce；PlantRegeneration1.前言细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学、遗传学、发育生物学等学科的原理和方法，通过某种工程学的手段，在细胞水平或细胞器水平上，根据人们的意愿对细胞进行改造，进而得到目的产物的一门综合科学技术柳俊等，2020。近年来，由于包括遗传学、分子生物学、生理学、工程学、生物物理学等学科的快速发展和融合，细胞工程再综合了各大学科的优势以及利用本身的特点后，也得到了极大的发展。细胞工程技术根
10、据对象分类，能够将其分为植物细胞工程、动物细胞工程和微生物细胞工程。它们之间的原理和方法都是相通的，但是又有微小的区别。植物细胞工程技术的发展源头能够追溯到上世纪初，发展到如今，其实它的应用已经非常的广泛。目前来讲，它已被广泛用于医学、能源、制药、农业育种、食品等方面的科学研究和生产应用。下面就主要对动物细胞工程和植物细胞工程技术在生产生活中的一些应用做一些简单的介绍。1.1动物细胞工程技术及其应用动物细胞工程主要是应用细胞生物学和工程学的研究手段和原理，通过细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植、基因转移等技术而发展起来的一门生物技术叶敏，1984。目前在细胞工程制药、细胞治疗、干细胞培养
11、、细胞核移植等方面有着非常广泛的应用李刚等，2002；唐红等，2020；马瑞丽，2007；。下面就下面几个方面对动物细胞工程技术的一些应用做一些简单的介绍。1.1.1生产单克隆抗体和细胞因子自1975年英国剑桥大学的科学家利用动物细胞融合技术初次获得单克隆抗体以来，如今针对各种抗原的单克隆抗体已被广泛应用于生命科学的各个领域，而细胞工程技术的发展对于单克隆抗体的生产无疑是提供了强大的技术支持。用单克隆抗体能够检测出多种病毒中非常细微的株间差异，尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。这些都是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且利用细胞工程技术生产
12、的单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强的特点，所以诊断非常准确，误诊率与传统血清学手段相比大大降低唐红，2020。不仅如此，近年来的发展也将细胞工程带入了肿瘤诊断的领域，利用生产的特异性单克隆抗体为肿瘤的检测和治疗提供了新的思路和方法。比方就有这样的报道，有科学家利用单克隆抗体耦联放射性核素，在肿瘤局部产生足够的电离辐射生物学效应，这在治疗卵巢癌的实验与临床研究已获得较大进展，给卵巢癌十分是术后复发及化疗耐药患者的治疗带来新的希望吴嘉涵，2020。1.1.2细胞融合技术细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并构成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞
13、工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也获得了创始性的研究成果。这其中其实也主要包括有单克隆技术马瑞丽，2007。但是，不仅是单克隆技术，细胞核移植技术也得到了很好的发展。自从1997年克隆羊多利诞生以来，相继在很多国家都报道出来已经克隆出各种动物，比方讲我国的克隆牛、克隆猪、克隆鼠等。克隆动物的技术最大的发展前景莫过于将它与转基因生物反响器结合起来，发展为类似于动物工厂的优势杂种细胞用于生产各种药物。这其中比拟成熟的比方有利用转基因动物乳腺作为生物反响器,生产基因工程人类蛋白质药物，它能够使成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低李刚等，20
14、02。1.2植物细胞工程技术及其应用植物细胞工程是以细胞的全能性和体细胞分裂的均等性作为理论根据，在细胞水平上对植物进行操作的育种新技术。植物细胞工程包括染色体工程技术、原生质体培养、花药培养、细胞培养与无性系挑选、组织培养与体系胞杂交、器官与胚胎培养、植物脱毒快速繁衍与人工种子生产技术等李培夫等，2006。植物细胞工程技术目前应用特别广泛，其中在作物育种方面的应用报道的最多。下面做些简单的介绍。1.2.1在植物作物育种中的应用我们知道，传统的杂交育种在自交5代以后能够产生一些同质配子结合的纯合植株，需要经6-8代才可选育出新品系。对于一年一季的植物，这之间需要花费最少5-8年的时间，甚至更久
15、。而单倍体育种是通过单倍体培养迅速获得纯合二倍体，进而大大缩短了育种年限，有些单倍体育种只需要两年左右的时间就能够得到纯种，为育种提供了极大的方便，而且选出的品种纯种率高柳成荫，2020；李培夫等，2006。目前我国在植物育种中的应用在很多方面都有建树。比方讲在水稻育种、菊花育种、茶树育种、枣树育种等等都有比拟深化的研究王婷婷，2020；白瑞霞,2007;邝琦,2020;邱涛涛,2020。1.2.2在农业生产中的应用在农业生产方面，目前，根据人们的需要已经相继完善和发展了一些具有特色的植物细胞工程实用技术，包括植物细胞组织培养技术、无性快繁技术及单倍体育种技术等，这些技术在脱毒苗生产、经济植物
16、快繁、植物新品种选育及有用次生代谢产物生产方面发挥了重要作用。植物细胞工程在脱毒苗生产方面的应用主要是想提高农产品的产量和质量。目前主要采用的方法和手段是茎尖剥离的方法。这在我国都已经得到了很大的推广。我国相继在黑龙江、内蒙古、湖南、湖北、河南和甘肃等地建立了生产脱毒种薯的原种场，目前，草莓、苹果、柑橘和葡萄等经济植物都已建立了脱毒苗生产技术柳成荫，2020。在其他方面，植物细胞工程在经济植物快繁方面的应用的技术也特别成熟。例如利用植物快繁技术能够使生根困难的珍贵花卉大量繁衍，还可应用于杂合植物材料的快速繁衍，由于很多优良的观赏植物和经济植物都是杂种，一旦有性繁衍，其后代性状会发生分离。而通过
17、无性繁衍则能够保持其杂合性，并能够大量生产性状均一的商品苗。目前已在木薯、马铃薯、咖啡、橡胶、菠萝、甘蔗和苹果等经济植物上建立了植物快繁技术杨贺，2020。1.2.3培养生产次生代谢物植物细胞培养作为一种有效生产有重要价值次生代谢物的技术.与其他方法相比,应用植物细胞培养技术生产次生代谢产物具有下面优点:(1)有利于研究植物的代谢途径,还能够利用某些基因工程手段探索与创造新的合成道路,得到价值更高的产品；(2)所获得产物可从培养体系内直接提取,快速、高效的回收与利用,简化了分离与纯化步骤；(3)节省大量用于种植原料的土地,以便土地资源得到高效利用；(4)能够减少各种环境因素对产物的影响,确保在
18、一个限定的生产系统中连续、均匀生产；(5)有利于细胞挑选、生物转化，合成新的有效成分；(6)能够在生物反响器中进行大规模培养,并通过控制环境条件提高代谢物产量。目前植物细胞工程技术应用于生产次生代谢的产物有植物生长经过中产生的一些酚类、萜类、含氮化合物罗凯，2007；谷荣辉等，2021。这其中很多对于我们有着非常重要的商业价值和药用价值。例如，一些重要的植物代谢产物具有抗癌防癌的药用成效；我国通过细胞培养已经用于商业化生产的次生代谢物主要有小檗碱、紫杉醇等,具有很好的抗癌、抑菌消炎活性(张玲华，2006)。除了药用外,很多次生代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料,如用作杀虫剂、染料、调味
19、品和香料等。总之,次生代谢物不仅是植物生命活动不可或缺的物质,而且对人类社会的生存发展也起着重要的作用。1.3本次实验的目的及意义1.3.1实验目的通过实验课程，把握细胞工程的核心技术-无菌操作技术和植物个体再生技术；通过实验课程和理论课程的学习，了解特殊器官离体发生调控技术；最后，通过整个经过，能够初步把握本领域的实验设计、结果分析及其报告/论文的撰写。1.3.2实验意义随着各个学科之间的深化融合和快速发展，细胞工程技术也得到了极大的发展，尽管动物细胞工程与植物细胞工程在技术和原理上都存在一定的差异，但其核心技术和原理是相通的，都是利用无菌操作技术和细胞的全能性等。所以通过植物细胞工程实验课
20、程，能够让我们对于细胞工程技术有较为深化的了解和把握，能够使我们学习到相关关键的操作技术。同时，在整个细胞工程实验经过中，我们还学习到了一些其他的技术，比方制作试管花卉、人工种子等，转基因水稻gus报告基因的瞬时表达和检测等等这些实验，使我们对其中一些的实验非常感兴趣。总之，本次实验既让我们学习到了相关的技术和原理，还激起了我们对其中的一些实验极大兴趣。2.实验材料与方法2.1实验材料2.1.1材料：无菌烟草苗2.1.2培养基诱导培养基：MS培养基+0.25mg/LNAA+0.25mg/LBA+8g/L琼脂分化培养基：MS培养基+0.25mg/LNAA+1.0mg/LBA+8g/L琼脂2.1.
21、3其他器材与试剂器材：天平、电磁炉、烧杯、移液管、三角瓶、灭菌锅、超净工作台、恒温25培养室等试剂：蔗糖、琼脂、MS培养基母液等2.2实验方法2.2.1无菌苗的培养教师准备2.2.2培养基的配置按配方参加各培养基成份。i.取一大的容量瓶，配制1000ml培养基母液备用。1000ml容量瓶中顺序参加已配好的培养基母液齐迎春等，2021：大量元素25ml，微量元素5ml，铁盐5ml，维生素5ml，肌醇5ml，甘氨酸5ml；其中，诱导培养基中再参加0.25mg/LNAA、0.25mg/LBA；分化培养基中参加0.25mg/LNAA、1.0mg/LBA。ii加好后，加水至总体积的3/4左右，参加20g
22、蔗糖搅拌使溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。iii.参加8g琼脂，置于电磁路炉上加热，搅拌使琼脂完全溶化，再用蒸馏水定容至终体积1000ml；继续加热几分钟使充分混均，分装于三角瓶中，每瓶20ml左右；用记号笔表明培养基类型。iv.灭菌教师准备。将分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件：温度121，压力1.1kg/cm2，时间20min。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。2.2.3愈伤组织的诱导培养将烟草叶片用剪刀剪成1cm2大小的小立方块，接种于已灭菌含诱导培养基的三角瓶中。每个三角瓶接种4-6片，注意不要过多；另外，在选取叶片时尽量不要选取叶片
23、的顶芽和芽尖，由于顶芽和芽尖的生长素浓度较高，不利于叶片的诱导；并且，将小叶片的四边都剪一下，以使叶片充分接触培养基。全程都在超净工作台中进行，严格控制无菌操作。每人接种六个三角瓶，三个放于光照条件实际为天天十二小光阴照下培养，另外三个置于黑暗条件全天黑暗下培养。培养三周。2.2.4器官的分化培养在诱导培养基中培养三周后，取出，将污染的材料废弃，将没有污染的材料接种到含分化培养基的三角瓶中，原则上是将原来一个三角瓶中材料转移到对应的一个含分化培养基的三角瓶中。由于光照条件下和黑暗条件下各有两瓶被污染了，而剩下的材料每个三角瓶又长得过多，所以将剩下的光照条件下的材料转移到了两个分化三角瓶中，将黑
24、暗条件下的材料转移到了三个分化三角瓶中。做好光照诱导和黑暗诱导的标记，置于光照下培养两个月左右，观察结果。3.实验结果与分析3.1实验结果统计3.1.1烟草叶片诱导结果统计烟草叶片诱导成愈伤组织统计表Statisticforcallusinductionoftobaccoleaves编号Number接种数Inoculationnumber愈伤组织构成数Callusnumber诱导率Inductionrate能否污染Pollution愈伤组织生长状态GrowthstateofcallusL16583.33%是被污染，没构成愈伤组织L255100.00%是被污染，但均构成愈伤组织，2个长根L366
25、100.00%否均长根，构成愈伤组织D15240.00%是被污染，有一个愈伤组织，且长根D2500.00%是被污染，无愈伤组织构成D355100.00%否2个长根，4个构成愈伤，1个没长3.1.2烟草叶片分化结果统计烟草叶片愈伤组织植株再生情况统计表Statisticforcallusdifferentiationandregenerationoftobaccoleaves编号Number愈伤组织;Sourceofcallus分化率Differentiationrate愈伤分化芽数Numberofsprout分化芽状态Stateofsprout愈伤植株数Numberofcallusplant株
26、苗状态Stateofplant污染率Pollution能否有芽Isthere大小Size密集程度DensityL1-1光照100%23有+1+0L1-2光照100%18有+3+0L1-3光照100%27有+2+0L1-4光照100%34有+0o0L2-1光照100%78有+8+0L2-2光照100%26有+3+0D1-1黑暗100%13有+2+0D1-2黑暗100%12有+3+0D1-3黑暗100%16有+3+0D2-1黑暗100%12有+3+0D2-2黑暗100%25有+2+0D2-3黑暗100%11有+1+0D3-1黑暗100%7有+1+0D3-2黑暗100%16有+7+0D3-3黑暗10
27、0%9有+2+0D3-4黑暗100%12有+0o0讲明：i.L表示光照条件下诱导，D表示在黑暗条件下诱导。ii.对于分化芽状态，在大小一栏，“+、“+、“+、“+、“+分别表示小、较小、适中、较大、大；在能否密集一栏，“+、“+、“+、“+、“+分别表示稀疏、较稀疏、适中、较密集、密集。对于株苗状态，“+、“+、“+、“+、“+分别表示短小、较短小、适中、较大、大；o表示无。Note：i.Lmeansinducedundertheconditionoflight；Dmeansinducedundertheconditionofdark；ii.Forthestateofsprout，inthes
28、izecolumn，“+、“+、“+、“+、“+standforsmall、lesssmall、moderate、lesslarge、large，respectively；inthedensitycolumn，“+、“+、“+、“+、“+standforsparsity、lesssparsity、moderate、lessdenseness、densenessrespectively。TotheStateofplant，“+、“+、“+、“+、“+standforsmall、lesssmall、moderate、lesslarge、large；omeansnoplant。3.2结果分析对烟草叶
29、片愈伤组织分化再生进行统计分析，以比照光照和黑暗条件下诱导对于植株再生的影响，整理出下面结果。3.2.1对分化率的影响由统计分析可知，不管是在光照条件还是在黑暗条件下诱导，最终分化率都到达了100%，所以光照条件和黑暗条件对于愈伤组织分化率没有影响。3.2.2对愈伤组织分化芽数的影响由统计数据可知，在光照条件下诱导总计分化芽数为206颗，在黑暗条件下诱导分化芽数为133颗，平均每个愈伤组织分别诱导出的芽数为34.33颗和13.30颗，经方差分析可得：光照和黑暗对愈伤组织分化芽数的影响方差分析差异源SSdfMSFP-valueFcrit行1140.7511140.757.6380.039666.
30、607891列1817.4175363.48332.4340.1756445.050329误差746.755149.35总计3704.91711根据方差分析能够得到P值小于0.05，所以在光照条件和在黑暗条件下诱导对愈伤组织分化芽数的影响到达了显著差异，在光照条件下诱导比在黑暗条件下诱导更有利于愈伤组织长芽。3.2.3对分化芽状态的影响对于分化芽状态，不管是在光照条件下还是在黑暗条件下诱导都不影响分化出芽，均能到达100%；对于分化芽的大小，同样能够做方差分析，能够得到光照和黑暗条件下诱导对分化芽的大小没有明显区别；对分化芽的密集程度进行分析，结果显示在黑暗条件下分化芽趋向密集生长，在光照条件
31、下诱导相对长得更稀疏。3.2.4对构成植株的影响由统计表进行方差分析能够得到光照条件下诱导和黑暗条件下诱导对构成植株数以及对于株苗构成的状态均没有显著的影响。3.3实验结果分析与讨论在诱导培养实验中，结果有66.7%的材料被污染了，分析其原因有一下几点：操作不规范，在操作经过中没有严格地根据无菌操作的实验要求来操作可能导致的污染；通风橱放置不是十分合理，当时我在的通风橱在门口，在操作经过中背后有来来往往的同学在走动，使染菌，由于跟我一起在一个通风橱一起做的另外两位同学也被污染了；可能是在接种完后在拿到培养室的经过中染的细菌，由于这个经过中并不是在无菌的环境中完成的。4.瞻望细胞工程技术目前来讲
32、都已经相当成熟。随着社会的发展和市场的需求，细胞工程技术必将继续发挥着其独特的优势以更好的应用于生产生活。动物细胞工程技术将继续聚焦于工程制药，例如单克隆抗体生产、细胞移植和核移植技术、细胞分化与干细胞培养、转基因治疗、人造器官移植等，关键是能够找到愈加强大、适用于表达培养的细胞系马瑞丽，2007；胡显文等，2001；另外，还要在减少动物和细胞使用量、怎样减少或铲除免疫排挤等方面攻克难关。将来在更多种类的人源化抗体方面的研究和生产也必将依靠于动物细胞工程的发展胡显文等，2001。植物细胞工程也同样关注制药方面，植物细胞生物反响器对于提取药物的有效成分有着很大的发展前景罗凯等，2007，这其中尤
33、其是对于中药的研究和开发。植物细胞工程在制药方面还有待于真正的工业化开发生产，主要的目的也是大量生产一些天然的药物赵玉平等，2021。细胞工程技术的应用前景还包括其他一些方面，比方用于环境保护、作物育种、农业生产等反面都有着非常大的应用前景。相信随着科学技术的发展，细胞工程技术给人类带来的福音也会越来越多。5.致谢感谢柳俊教师这个学期对我们的辛勤指导，不管是实验课上还是理论课上，您的科学的实验方法、严谨的学习态度、幽默的教学风格对我的学习、生活都有很大的帮助；感谢齐迎春教师给我们的指导和帮助我们认真地准备实验材料；感谢陈浩教师给我们指导转基因水稻的相关实验；感谢各位师兄师姐对我们的指导；感谢我
34、的队友，感谢我班上的所有同学，感谢身边所有人，让我的世界如此的丰富多彩！参考文献：柏家林.哺乳动物细胞高效表达系统研究进展J,西北民族大学学报自然科学版,2021年3月,第34卷总第89期：4351.白瑞霞,张媛,彭建营.植物细胞工程技术在枣育种中的应用J.干果研究进展,2007:164168邝琦,余倩花,周厚高.植物细胞工程在菊花育种中的应用J.北方园艺2020(4):220224.谷荣辉,洪利亚,龙春林.植物细胞培养生产次生代谢物的途径J.植物生理学报PlantPhysiologyJournal2021,49(9):869881.胡显文,肖成祖.细胞工程在生物制药工业中的地位J.生物技术通
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