动物细胞工程(上课).ppt

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1、动物细胞工程动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体制备单克隆抗体制备动物体细胞动物体细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物思考与回忆： 1 1、动物细胞全能性特点？、动物细胞全能性特点？ 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。能变窄。细胞核仍具有全能性。 2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？成动物个体？ 不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件

2、，由于细定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。的细胞培养。 3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？、动物的细胞培养的理论依据（原理）？ 细胞增殖细胞增殖动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础一、动物细胞培养的应用和概念：一、动物细胞培养的应用和概念：1

3、 1、概念：、概念：动物细动物细胞培养就是从动物胞培养就是从动物有机体中取出相关有机体中取出相关的的组织组织, ,将它分散将它分散成成单个细胞单个细胞, ,然后然后, ,放在适宜的放在适宜的培养基培养基中中, ,让这些让这些细胞生细胞生长和增殖长和增殖. .2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖定义：定义：人们通常将人们通常将动物组织动物组织消化后消化后的的初次培养初次培养称为原代称为原代培养。培养。胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长贴壁生长长成单层细长成单层细胞

4、。有胞。有接触抑制接触抑制现象）现象）。原代培养原代培养3 3：过程：过程图示图示原代培养原代培养强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易表面光滑、无毒、易于帖附。于帖附。当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时, ,细胞就会停止分裂增细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细殖，这种现象称为细胞的接触抑制。胞的接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制当继续传代培养时，当继续

5、传代培养时，少部分细胞会克服细少部分细胞会克服细胞寿命的极限，获得胞寿命的极限，获得不死性，这些细胞已不死性，这些细胞已经发生了突变，正在经发生了突变，正在朝着同等于癌细胞的朝着同等于癌细胞的方向发展。方向发展。 左图显示了创面愈合过程左图显示了创面愈合过程中一个十分有趣的现象。中一个十分有趣的现象。当周边的上皮向创面中央当周边的上皮向创面中央爬行时爬行时,一旦上皮细胞互相一旦上皮细胞互相接触接触,就停止分化和增殖。就停止分化和增殖。该现象就叫该现象就叫“接触抑制接触抑制”。因此因此,创面上不会出现多余创面上不会出现多余的皮赘。这是一种十分巧的皮赘。这是一种十分巧妙和妙和“神秘神秘”的调控现象

6、。的调控现象。细 胞 的 接 触 抑 制细 胞 的 接 触 抑 制动物组织细胞间隙中含有一定量的弹动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。成具有一定弹性和韧性的组织和器官。用用胰蛋白酶胰蛋白酶分散细胞。动物细胞培养分散细胞。动物细胞培养适宜的适宜的pH为为7.27.4，此环境下胃蛋，此环境下胃蛋白酶（白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶）没有活性，而胰蛋白酶（7.2-8.4）的活性较高。）的活性较高。 定义：定义： 当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后, , 用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理

7、处理, ,使细胞从瓶壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下下来来, ,然后加入新的培养液然后加入新的培养液, ,将将细胞分离稀释细胞分离稀释, ,并并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内从原培养瓶内转接到新的培养瓶内, ,这这个过程称个过程称传代培养传代培养. .（分瓶培养的过程分瓶培养的过程）传代培养传代培养有关概念比较有关概念比较 原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。为原代细胞。一般培养的第一般培养的第1 1代细胞与传代细胞与传1010代以内的细胞称为原代细胞培养。代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，将原代细胞从培养瓶中

8、取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念比较有关概念比较细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代

9、，这改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。3 3、总结：动物细胞、总结：动物细胞培养过程培养过程动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物的组织、器官的组织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释传代传代1010

10、代以内，代以内，遗传物质不改变，遗传物质不改变，保持保持正常正常二倍体核型二倍体核型。传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢以代左右，增长缓慢以至于完全停止，至于完全停止，部分细胞核型可部分细胞核型可能发生变化能发生变化（遗传物质可能改变（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？为什么用胰蛋白酶处理？分瓶分瓶传代培养传代培养原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、细胞贴壁、接触抑制接触抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不获得不死性死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经遗传物质已经改变改变，等同于癌细胞等同于癌细胞。原原代代培培养养4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件

11、: :1 1）无菌无毒）无菌无毒 的环境：的环境： 适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为人和哺乳动物细胞最适温度为36.536.50.50.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PHPH：7.2-7.47.2-7.4液体合成培养基：（液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）因子、（水、无机盐、微量元素）等；通等；通常还需加入常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。4 4）气体环境：）气体环境：2 2）营养：）营养：3 3）温度和）温度和pHpH：“95“95空气空气+5+5COCO2 2” ”的混合气体培养箱。的混合气体培养

12、箱。氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的； COCO2 2维持培养维持培养液的液的PHPH。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。造成危害。问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？问题问题1 1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为

13、其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物

14、细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适，胰蛋白酶作用的适宜宜PH为为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜，胃蛋白酶适宜PH为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在PH为为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。的动物细胞培养中无活性。问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？组培培养基有何独特之处？问题问题7 7、动物细胞培养能

15、否像绿色植物组织培养那样最、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：生素和动物血清等。独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体育成新的动物个体问题问题8 8、动物细胞培养的原理：、动物细胞培养的原理： 细胞增殖。细胞增殖。问题问题9 9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在、目前使用的或冷

16、冻保存的正常细胞通常在1010代代以内，为什么？以内，为什么？1010代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用: :1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和

17、动物细胞培养的比较：植物组织培养和动物细胞培养的比较：见导学教程见导学教程P31表表比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 促促- - - - 动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白取材取材植物幼嫩部分或植物幼嫩部分或花药花药胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物的器

18、官或组织的器官或组织其他条件其他条件无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件 2 2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是细胞是 （ ） A A获得不死性的细胞获得不死性的细胞 B B1010代以内细胞代以内细胞 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞1 1、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是 （ ） A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养A AD D课堂反馈练习课堂反馈练习3 3、在动物细胞培养的有关叙述中

19、正确的是：、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（ ）A A、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞 分泌蛋白分泌蛋白B B、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散C C、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡 过程中过程中D D、培养至、培养至5050代后传代细胞遗传物质没有发生改变代后传代细胞遗传物质没有发生改变B B4 4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（ ）无毒的环境无毒的环境 无菌的环境无菌的环境 培养基

20、需要加入血培养基需要加入血清清 温度与动物体温相似温度与动物体温相似 需要需要O O2 2，不需要，不需要COCO2 2 COCO2 2能调节培养液能调节培养液PHPHA A、 B B、 C C、 D D、 D D5 5、动物细胞培养的特点、动物细胞培养的特点 （ ）细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 细胞分化细胞分化 接触抑制接触抑制 减数分裂减数分裂 原代培养一般传原代培养一般传1 11010代代A A、 B B、C C、 D D、A A6 6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：此回答：（1 1）容器）容器A A中放置的是动物器官或组

21、织。它一中放置的是动物器官或组织。它一般取自般取自_。（2 2）容器）容器A A中的动物器官或组织首先要进行的中的动物器官或组织首先要进行的处理是处理是 ，然后用，然后用 酶处理，酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是是 。动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物物剪碎剪碎胰蛋白胰蛋白使细胞与培养液充分接触，便于培养使细胞与培养液充分接触，便于培养（3 3）培养首先在）培养首先在B B瓶中进行，瓶中的培养基成瓶中进行，瓶中的培养基成分有分有 _等。在此瓶中培养等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到

22、第到第 代，到这时的培养称为代，到这时的培养称为_ _ 。（4 4）为了把）为了把B B瓶中的细胞分装到瓶中的细胞分装到C C瓶中，用瓶中，用 处理，然后配置成处理，然后配置成 ，再，再分装。分装。 动物血清动物血清10原代培养原代培养胰蛋白酶胰蛋白酶细胞悬浮液细胞悬浮液二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：定义： 动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞一个细胞的细胞核的细胞核, ,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的卵母去掉细胞核的卵母细胞中细胞中. .使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎, ,这这个新的胚胎最终发育为个新

23、的胚胎最终发育为动物个体动物个体. .3、分类：分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分困难全能性十分困难2、原理：原理： 动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性4、体细胞核移植过程、体细胞核移植过程-示动物克隆示动物克隆-无性繁殖无性繁殖1.）克隆羊多）克隆羊多利培育过程：利培育过程：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组

24、胚胎早期重组胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利特别注意：特别注意：克隆动物性状克隆动物性状与供体动物完全一样吗？与供体动物完全一样吗？不可能！不可能！因为：因为：一、供体动物只提供细胞核，一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如而细胞质中的遗传物质（如线粒体线粒体DNA）来自于受体卵）来自于受体卵母细胞母细胞.二、生物的性状不仅与遗传二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。物质有关，还受环境的影响。供体供体受体受体代孕代孕受体受体黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a重组细胞重

25、组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1、写出、写出AB所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a表示：表示： b表示表示: 2、实施细胞工程时，所需、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞受体细胞大多采用卵母细胞的原因：的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。表达全能性的物质和营养条件。3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。4 4、若黑面绵羊的基因型为、若黑面绵羊的基因型为AA,AA,

26、白白面绵羊的基因型为面绵羊的基因型为aaaa，则克隆羊，则克隆羊的基因型为的基因型为 核移植核移植胚胎移植胚胎移植白色白色多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊aa多利的一生多利的一生姓名：姓名：多利多利性别：性别：雌雌种族：种族：哺乳纲、牛科、绵羊哺乳纲、牛科、绵羊生日：生日：1996年年7月月5日日出生地：出生地：苏格兰苏格兰基因父亲：基因父亲：无无基因母亲：基因母亲：一只芬兰白绵羊一只芬兰白绵羊线粒体母亲：线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊一只苏格兰黑脸羊生育母亲：生育母亲：另一只苏格兰黑脸羊另一只苏格兰黑脸羊进入社交圈时间：进入社交圈时间：1997年年2月月23日日子女

27、：子女：生育生育6名，存活名，存活5名名死亡：死亡：2003年年2月月14日日 取供体细胞取供体细胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞以内的细胞. .为什么？为什么？用的是去用的是去核的减数核的减数第二次分第二次分裂中期细裂中期细胞（胞（M中中期期）为什）为什么？么？激活方法：激活方法：激活目的：激活目的：促融方法：促融方法：电刺激电刺激胚胎移植至胚胎移植至代孕受体内代孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩2.）核移植流程）核移植流程供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）母细胞的采集与培养） 1.体积大，易体积大，易操作。操作。2.含有含有促使

28、细胞核表促使细胞核表达全能性的物达全能性的物质和营养条件。质和营养条件。有人说它三个母有人说它三个母亲，对吗？亲，对吗？核移植流程核移植流程:1、供体细胞的采集与培养、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减数分裂进程。数分裂进程。6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞、将供体细胞注入去核卵母细胞3、显微操作去除卵母细胞中的核、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛

29、体内、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。 1、核在进行体细胞核移植之前，、核在进行体细胞核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？为何要去掉受体卵母细胞的核？讨论讨论 为使核移植动物的遗传物质全部来为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。自有利用价值的动物提供的细胞。 2、细胞核移植生产的克隆动物是对、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为的复制吗？为什么？什么？ 不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNA来自供来自供体细胞核，但核外还有少部分体细胞

30、核，但核外还有少部分DNA（如线（如线粒体粒体DNA）来自受体卵母细胞。）来自受体卵母细胞。对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？过程，找出操作过程的不同点？ 多莉克隆过程的受体细胞是去核多莉克隆过程的受体细胞是去核卵卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核胞是去核卵母卵母细胞；多莉克隆过程是将细胞；多莉克隆过程是将供体供体细胞核细胞核注入受体细胞，而高产奶牛注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体的克隆过程是将供体细胞细胞注入受体细胞。注入受体细胞。想一想想一想 卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、卵母细胞

31、当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功。功。 将供体细胞注入受体细胞，使克隆动将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便。物更像供体动物，操作也方便。讨论分析上述哪一种措施更科学？讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？并说明理由？想一想想一想2.2体细胞核移植的应用前景：体细胞核移植的应用前景：在畜牧业中可以加速家畜遗传改在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程良的进程保护濒危物种保护濒危物种医药卫生领域生产医用蛋白质及组医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植织器官的移植了解胚胎发育和衰老过程；追踪研了解胚胎发育和衰老

32、过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病究疾病的发展过程和治疗疾病4.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景1.在畜牧业上，利用体细胞克隆技术促进优良畜群繁殖。2.保护濒危物种。4.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景3.5.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题看书看书P49-50P49-50页页黑面绵羊去黑面绵羊去核卵细胞核卵细胞白面绵羊卵白面绵羊卵腺细胞核腺细胞核重组细胞重组细胞早期胚胎早期胚胎另一头母绵羊子宫另一头母绵羊子宫克隆绵羊多莉克隆绵羊多莉ab电脉冲处理妊娠、出生1 1、定义：、定义：指用自然或人工方指用自然或人工方法使两个或多个不同的

33、细胞法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。融合成一个细胞的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合细胞杂交：细胞杂交：不同基因型的细不同基因型的细胞之间的融合就是胞之间的融合就是细胞杂交细胞杂交。杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具融合后形成的具有原来有原来两个或多个细胞遗传两个或多个细胞遗传信息信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细成为杂交细胞胞。 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用动物动物细胞细胞融合融合2、诱导融合的因素诱导融合的因素 生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融诱导融合合.(.(利用灭活仙台病毒是动物细利用灭

34、活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。胞融合所特有的。 这是由于病毒这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。功能。) ) 化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融诱导融合合. . 物理法：物理法：电激电激融合融合病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞3 3、动物细胞融合技术的应用、动物细胞融合技术的应用 细胞融合技术突破了有性杂交的局限

35、，使细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。远缘杂交成为可能。 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。 人们获得抗体的传统方法是人们获得抗体的传统方法是? ?将抗原注入动物体将抗原注入动物体, ,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么? ?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。能产生严重的过敏反应。 运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ 能否用单个能否用单个B B淋巴细胞通过克隆形成的

36、细胞群来淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？产生单一类型的抗体呢？B B淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备思思考考单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能和具有无限增殖能力的力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种

37、的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 米尔斯坦米尔斯坦( (阿根廷阿根廷) )和科勒和科勒( (德国德国) )因此在因此在19841984年获诺年获诺贝尔奖。贝尔奖。提取提取用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基1.动物特异性免疫动物特异性免疫2.分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意）。注意B淋巴细淋巴细胞是一个系列。（胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;GG）4.第一次筛选：

38、在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有BG杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：杂交瘤细胞也是一个系列：如如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）5.第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列每孔每孔只放一个杂交瘤细胞。只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进行行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。瘤

39、细胞。6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔内增殖内增殖。7.提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。1、单抗的制备过程要点：、单抗的制备过程要点：4 4）、如何进行第）、如何进行第2 2次筛选？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？

40、免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体(8)(8)为什么不用两个而要用多个细胞进行动为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？物细胞间的融合？ 就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理就目前常用

41、的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是不可能是100%100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们

42、知道，体内产生的特异性抗体种类可多我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个达百万种以上，但是每一个B B淋巴细胞只分泌淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。的杂交瘤细胞。 1、作为诊断试剂作为诊断试剂：

43、在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等, ,与常规抗体相比与常规抗体相比, ,具有具有准确、高效、准确、高效、简易、快速简易、快速特点特点. 2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物： 主要用于癌症治疗。主要用于癌症治疗。 生物导弹：生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+ +放射性同位素放射性同位素+ +化学化学药物或细胞毒素药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）胞位置，原位杀死癌细胞。） 特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制

44、备。3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用单克隆抗体的概念：单克隆抗体的概念： 由一个由一个效应效应B淋巴细胞淋巴细胞经过无性繁殖形经过无性繁殖形成的一个细胞群产生的化学性质单一，特异成的一个细胞群产生的化学性质单一，特异性强的抗体，即性强的抗体，即单克隆抗体单克隆抗体。单个细胞单个细胞无性繁殖无性繁殖化学性质单一，特异性强化学性质单一，特异性强单：单：克 隆 ：克 隆 ：抗体：抗体：单克隆抗体的特点：单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高、产量大特异性强、灵敏度高、产量大课堂小结课堂小结两个过程两个过程动物细胞融合过程动物细胞融合过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个

45、诱导细胞融合的新方法灭活病毒一个诱导细胞融合的新方法灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性强、一个优势单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势灵敏度高的优势B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案风杆菌单克隆抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂

46、，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50例例3 3：4. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞淋巴细

47、胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） 淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞A BC D C6.6.右图是某种淋巴细胞，膜右图是某种淋巴细胞，膜外颗粒状物质为抗体。据图外颗粒状物质为抗体。据图回回 答：答：（1 1）这是）这是细胞，细胞，它是由它是由分化而分化而来。来。（2 2）抗体从开始合成）抗体从开始合成到分泌出细胞，经过的细胞到分泌出细胞，经

48、过的细胞结构顺序是（填标号）结构顺序是（填标号）。抗体的分泌说明细胞的。抗体的分泌说明细胞的各种生物膜在结构上具有各种生物膜在结构上具有。并以。并以的形的形式转变。式转变。（4 4）抗体的化学本质是）抗体的化学本质是，它能与，它能与发生特异性结合，发挥免疫效应。该过程属发生特异性结合，发挥免疫效应。该过程属于于免疫的免疫的阶段。阶段。（5 5）若该抗体是单克隆抗体，则该细胞名称为）若该抗体是单克隆抗体，则该细胞名称为。在制备单克隆抗体的过程中，应用。在制备单克隆抗体的过程中，应用的动物细胞工程的技术手段是的动物细胞工程的技术手段是。（3 3）在分泌抗体时要消耗由）在分泌抗体时要消耗由提供的能量

49、。提供的能量。思考与探究思考与探究1习题答案习题答案 细胞的衰老与动物机体的衰老细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼龄动物则相反。所以，一般来说幼龄动物的组织细胞比老龄动物的组织动物的组织细胞比老龄动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增值能力越强，分化程度越低，则增值能力越强，所以更易于培养。所以更易于培养。 思考与探究思考与探究2 动物细胞的培养有

50、各种用途，动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完胞发育潜能变窄，失去了发育成完整生物个体的能力，所以，动物细整生物个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成为向诱导动物干细胞，使其分化成为所需要的组织或器官。所需要的组织或器官。思考与探究思考与探究3 （1）可以。卢辛达的