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1、临床检验基础实验指导临床检验基础学实验指导血液常规检验一、微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定与使用【实验目的】：把握微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定、构造与使用。【实验试剂】：红细胞稀释液、75乙醇、消毒药棉。【实验器材】：一次性采血针、计数板、盖玻片、微量吸管、2ml吸管、中号试管、显微镜、小玻璃棒。【实验原理】：一次性采血针刺破毛细血管后，用微量吸管汲取一定量的血液，稀释一定的倍数，冲入计数池计数一定体积内的细胞的数量。【实验方法】：一、微量吸管的使用：用抗凝血训练微量吸管的使用。二、毛细血管采血以红细胞计数为例：准备：取清洁枯燥试管一支，加2ml红细胞稀释液。采血部位选
2、择、推拿75乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒待酒精挥发干否则血流不成滴自指尖腹内侧迅速刺针擦去第一滴血准确汲取10ul血液用无菌干棉球压住伤口止血用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液释放到稀释液底部回吸上清液2-3次轻轻混匀。三、计数板构造与应用1计数板构造外观构造：每块计数板由“H型凹槽分上下两个计数室，在计数室两侧各有一条支柱，比计数室高出0.1mm，将一块平整光滑的血细胞计数专用盖玻片24.0mm20.0mm0.6mm覆盖其上时，盖玻片与计数室间构成0.1mm的缝隙。格子构造：计数池长、宽各3mm，平均分成9个大格，每个大方格的容积是0.1mm3四角的四个大方格分别用单线划分成16个中方格，
3、是白细胞计数区域；中央的大方格用双线条划分成25个中方格，每个中方格又用单线划分成16个小方格，其中四角和正中的5个中方格是红细胞计数区域。2计数板的使用：用清洁枯燥柔软的纱布擦拭计数板及盖玻片用推盖法从计数板下缘向前平推盖玻片将其盖在计数室上充分混匀细胞悬液充池静置观察细胞分布情况若严重不匀，应重新充池。【注意事项】：1采血部位应选择皮肤完好，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2针刺应迅速，深度适宜约23mm。待血液自行流出，擦去第一滴血。3微量吸管取血时应将微量吸管管尖侧着插入血滴中央。若血流不暢，能够左手自采血部位远端向指尖稍压力至血液流出为止。切忌用力挤压，造成组织液混入，影响结果准
4、确性。4计数板在使用中勿让手指接触计数池及盖玻片外表，以访油腻污染，致使充液时起泡。二、血涂片的制作,瑞氏染色【实验目的】：把握血片制作方法，瑞氏染色原理及方法。【实验试剂】：瑞吉氏复合染液液、液【实验器材】：显微镜、载玻片、推玻片、一次性针头、消毒棉球、洗耳球【实验原理】：细胞的着色既有化学的亲和作用，又有物理的吸附作用，不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不一样，所以对染料的亲和力也不一样，因而将细胞染成不同的颜色。【实验方法】：一、瑞一吉氏复合染液配制液：取瑞特染粉1g，吉姆萨染粉0.3g，置干净研钵中，加少量甲醇分析纯，研磨片刻，吸出上层染液，再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上
5、层染液。如此连续几次，共用甲醇500ml。采集于棕色瓶中，天天早晚各振摇3共5天，再存放一周，将染液过滤后即可使用。液：磷酸盐缓冲液PH6.56.8，取磷酸二氧钾无水6.64g，磷酸氟二钠无水2.56g，加少量蒸馏水溶解，调整PH后，加水至1000ml。二、血片制作、瑞氏染色方法准备：取清洁枯燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。1、制备血涂片：取载玻片取血1滴于载玻片右端边缘留1.5cm空隙左手持载玻片，右手持推玻片将推玻片放至血滴前沿逐步后移至血滴沿推片散开后，推玻片与载玻片成3035的夹角以平稳的速度将血液向前推进枯燥手持载玻片末端迅速在空气中挥动枯燥。2、染色：将干透的血涂片放在水平位置
6、加瑞吉氏复合染液液数滴，以染液覆盖整个血膜为度静置染0.51min滴加约2倍于液量的液用洗耳球吹气混匀染色510min平持玻片用流线型水洗枯燥镜检【注意事项】：1严格皮肤消毒。2.血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。3.染料放置时间越长，美兰逐步氧化为天青，染色效果越好。4染液淡，室温低，细胞多则染色时间长，反之减少染色时间。5水洗方法为平持血涂片流线型水缓缓冲洗干净，不要先倒掉染液。三、白细胞计数WBC【实验目的】：把握白细胞计数的原理、操作方法与结果报告。【实验原理】：用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并毁坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，
7、经换算求出每升血液中的白细胞数量。【实验试剂】：白细胞稀释液【实验器材】：显微镜、改进Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒【实验方法】：准备：取清洁枯燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。采血部位推拿75乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒待酒精挥发干否则血流不成滴自指尖腹内侧迅速刺针擦去第一滴血准确汲取20ul血液用无菌干棉球压住伤口止血用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液轻轻释放到稀释液底部回吸上清液2-3次混匀室温静置至液体变为棕褐色即红细胞毁坏完全清洁计数板、盖玻片充池静置23min待细胞下沉低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数计算报告。计算：WBC=四个大方格内的白细胞数N/41
8、020106=N/20109/L【注意事项】：1采血部位应选择皮肤完好，不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。2针刺应迅速，深度适宜约23mm。待血液自行流出，擦去第一滴血。3.稀释液要过滤使用，试管、计数板均须清洁，以免混入杂质被误以为白细胞。4.加稀释液、血液量应准确，以保证稀释倍数。5.计数池内细胞分布要均匀，每个大方格间白细胞数差异不得超过均值的10，否则要重新充液计数。6.严格把握计数原则，以免人为扩大或缩小计数区域。7.白细胞数量过高时，可加大稀释倍数，反之白细胞过低时可计数8个大方格内白细胞数或加大取血量。四、白细胞分类计数DC【实验目的】：把握显微镜法外周血分类计数的方法、各种白
9、细胞的镜下形态。【实验原理】：将血液制备成涂片，经瑞吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：瑞吉氏复合染液【实验器材】：显微镜、外周血标本片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：血涂片制备及瑞吉氏染色待干低倍镜下选择细胞分布均匀、着色良好的区域转油镜按一定的规律移动视野，依次进行分类计够100个白细胞算出各种白细胞的百分比报告【注意事项】：1.涂片制备要厚薄适中、均匀、头体尾分明。2.分类时要有程序地连续进行，避免主观选择视野。3.分类中如见幼红细胞，不计入100个白细胞内，以分类100个白细胞经过中见到幼红
10、细胞多少个来报告，并应注明其所属阶段，4.分类中应注意观察成熟红细胞、血小板的形态染色及其分布情况，注意有无寄生虫如疟原虫及其他异常所见。五、白细胞计数WBC及分类计数(DC)【实验目的】：把握白细胞计数及分类计数原理、方法与结果报告【实验原理】：白细胞计数原理：用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并毁坏红细胞，充入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积的白细胞数，经换算求出每升血液中的白细胞数量。白细胞分类计数原理：将血液制备成涂片，经瑞吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占百分比。【实验试剂】：白细胞稀释液、瑞吉氏复合染液【实验器材】：
11、显微镜、改进Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒、载玻片、推玻片、香柏油、擦镜纸、清洁剂【实验方法】：准备：1.取清洁枯燥试管一支，加0.38ml白细胞稀释液。2.取清洁枯燥载玻片，边缘光滑清洁推玻片各一张。采血部位推拿75乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒待酒精挥发干否则血流不成滴自指尖腹内侧迅速刺针擦去第一滴血准确汲取20ul血液用无菌干棉球擦去管尖外围余血后将血液轻轻释放到稀释液底部回吸上清液2-3次混匀另取血一滴于载玻片的右端立即推制血膜用无菌干棉球压住伤口止血清洁计数板、盖玻片充池静置23min待细胞下沉低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数将干透的血膜进行瑞吉氏染色油镜下分类计数
12、计算报告。六、红细胞计数RBC、Hb测定【实验目的】：把握红细胞计数，Hb测定原理、操作方法，规范的报告结果【实验原理】：红细胞计数原理：用等滲稀释液将血液稀释一滴倍数，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经换算求得内升血液中的红细胞数。Hb测定HiCN法原理：血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合构成稳定地氰化搞铁血红蛋白HiCN，HiCN在规定波长540nm和液层厚度1cm的条件下具有一定的毫摩尔消光系数。可用标准的高精度分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。【实验试剂】：红细胞稀释液甲醛枸木缘酸
13、盐稀释液，HiCN转化液【实验器材】：改进Neubauer计数板、显微镜、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、玻璃棒、【实验方法】：RBC：取清洁枯燥试管一支加红细胞稀释液1.99ml加未梢血10ul于稀释液底部汲取上清液嗽洗34次颠倒混匀清洁计数板，盖玻片充液静置23计数中央大格中四角及正中5个方各细胞数计算RBC=5个中方格细胞数510200106=5个中方格细胞数1012/L。Hb测定:1.直接定量测定法：取中号试管一支加HiCN转化液5ml加未梢血20ul混匀静置5721比色，波长540nm，以转化液为空白对照管测其吸光度“A计算“A367.7报告2.标准曲线法：将血红蛋白标准液稀释成不同
14、的三种浓度150g/L、100g/L、50g/L分别测其吸光度“A，以“A为纵坐标，血红蛋白标准液参考值g/L为横坐标，绘制标准曲线。通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度。【注意事项】：1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过渡挤压，红细胞数量明显增高者可适当加大稀释倍数。2.HiCN转化液应置棕色瓶于4冰箱中，不能储存于白色瓶、塑料瓶及强光下，否则会使CN丢失，结果偏低。3HiCN转化液中有氧化钾剧毒，防止污染。测定后的比色液不能与酸性溶液混合，否则可产生剧毒的氢氰酸气体。4.所用分光光度计的波长、吸光度需要校正，带宽应小于1nm，比色杯光径1.000cm时
15、，测定温度为2025。七、血液常规检验【实验目的】：把握血常规的连续操作规程并规范的报告结果。【实验原理】：见实验二、三、四、六【实验试剂】：红细胞稀释液、白细胞稀释液、瑞吉氏复合染液、HiCN转化液【实验器材】：改进Neubauer计数板、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、显微镜、玻棒。【实验方法】：取大、中、小号试管各一支分别加HiCN转化液5ml、红细胞稀释液2ml、白细胞稀释液0.38ml手指消毒针刺分别取未梢血10ul于红细胞稀释液中、20ul于白细胞稀释液中、20ul于HiCN转化液中并及时混匀取清洁枯燥玻片粘取1滴血液于玻片一端推制血片待干721比色瑞氏染色白细胞及红细胞计数DC计
16、算报告血常规结果报告正常值：成人儿童新生儿1.WBC:410109/L512109/L1520109/L成年男性成年女性儿童2.RBC:45.51012/L(3.5-5)1012/L(6-7)1012/L3.HB:120-165g/L110-150g/L170-200g/LL：2040M：38E：0.55B：01【注意事项】：1.取血应顺利、准确，采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症，不得过度挤压。2HiCN转化液中有氧化钾巨毒，防止污染。测定后的比色液不能与酸性溶液混合，否则可产生剧毒的氢氰酸气体。3细胞计数混合不易过分震摇。4.瑞氏染色时加染液与缓冲液的比例为1：1或1：2。5.采取
17、标本的顺序：红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数、血片制作八、血小板计数BPC或PLT【实验目的】：把握血小板的计数原理、方法、镜下形态及结果报告。【实验原理】：用稀释液将血液稀释一定倍数后混匀，充入计数池中，于显微镜下计数一定体积的血小板数，经换算求得每升血液内的血小板数。【实验试剂】：10g/L草酸铵液【实验器材】：显微镜、：改进Neubauer计数板【实验方法】：准备：取清洁枯燥的小试管一支，加10g/L草酸铵液0.38ml准确取自然流出的外周血20ul轻轻放入到上述稀释液底部回吸上清液漱洗吸管23次混匀室温静置10min清洁计数板、盖玻片混匀细胞悬液后充池静置10min15min于高倍
18、镜下计数中央大方格内四角和中央5个中方格内血小板总数计算报告计算：血小板数/L5个中方格内血小板总数109/L【注意事项】：1.所用试剂、器材应10g/L草酸铵液稀释液中无尘埃、细菌等污染。2.毛细血管采血时，针刺深度应达3mm。采血要快避免血液凝固.若遇血小板成簇分布时，应重采标本计数.3.细胞悬液充入计数池中静置时，应注意保持湿度，避免水分蒸发。4.计数光阴线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃的鉴别。血小板为轻度折光性的园形、椭园形。5血小板计数应在1h内完成，否则结果可降低。九、网织红细胞计数RC【实验目的】：把握网织红细胞计数原理、测定方法、镜下形态、结果报告。【实验原理】：网织红
19、细胞为晚幼红细胞脱核后，但尙未完全成熟的红细胞。其胞质中尙残存核糖体、核糖核酸等碱性物质，经活体染色后于胞质中可见蓝绿色网点状或点粒状构造。【实验试剂】：10g/L黄焦油篮生理盐水溶液【实验器材】：显微镜、试管、载玻片、推玻片【实验方法】：准备：取清洁枯燥小试管一支，加10g/L黄焦油篮生理盐水溶液23滴取外周血23滴于上述试管中立即混匀37下染色1520min取试管里的混合血液一滴于载玻片一端推制成薄血膜待枯燥油镜下计数于目镜筒中放一缩小视野的硬纸片至少1000个红细胞中的网织红细胞数计算报告计算：网织红细胞百分比计数的网织红细胞数/100【注意事项】：1.网织红细胞必须在活体染色下才能显示
20、。2.染色时血液与染料的比例约为1：1，贫血时适当增加血量，室温较低时适当延长染色时间或置37温箱.3.涂片应厚薄适宜，以红细胞不重叠为度，涂片后应及时计数，否则网状构造消失。4.计数区域一般选择血膜的体部，自体部向尾部迂回检查。十、嗜酸性粒细胞计数【实验目的】：把握嗜酸性粒细胞直接计数的原理、操作方法、镜下形态及结果报告。【实验原理】：用嗜酸性粒细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，毁坏红细胞和其他大部分白细胞并使嗜酸性粒细胞着色，滴入血细胞计数池，显微镜下计数一定体积内的嗜酸性粒细胞，经换算得出每升血液中嗜酸性粒细胞数。【实验试剂】：2伊红丙酮嗜酸性粒细胞稀释液【实验器材】：显微镜、改进Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒【实验方法】：准备：取清洁枯燥试管一支，加0.38ml嗜酸性粒细胞稀释液。准确汲取外周血20ul轻轻放入到上述稀释液底部回吸上清液漱洗吸管23次混匀室温静置清洁计数板、盖玻片混匀细胞悬液后充池静置3min5min于低倍镜下计数两侧计数池中10大方格每侧计数池的四角和中央大方格内的嗜酸性粒细胞数计算报告计算：嗜酸性粒细胞数/L10个大方格内嗜酸性粒细胞数20106/L