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1、植物生理学研究法（植物生理学研究法）(课程实习)论文题目：秋海棠和一串红对水分胁迫下的生理响应目录一、实验设计方案-3二、实验预习报告-4实验一植物组织中过氧化氢含量的测定实验二蒽酮法法测定可溶性糖实验三植物细胞膜透性的测定电导仪法实验四植物叶片水势测定实验五植物组织游离脯氨酸含量的测定实验六叶绿体色素的定量测定实验七植物组织含水量的测定三、测定数据记录及计算-12四、课程论文-143.预习报告实验1植物组织中过氧化氢含量的测定一原理植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2能够直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，进而加速细胞的衰
2、老和解体。过氧化氢酶能够去除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因而，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量。H2O2与硫酸钛或氯化钛生成过氧化物钛复合物黄色沉淀，可被HSO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。二植物材料：一串红叶片和秋海棠叶片三仪器设备研钵；移液管0.2ml2支，5ml1支；10mL试管30只；离心机；分光光度计。四试剂配制100mol/LH2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O257l，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%W/V硫酸钛；丙酮；
3、浓氨水。五实验步骤及注意事项1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1参加试剂。待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用丙酮少量屡次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。2.样品提取和测定：(1)秋海棠每个灌水梯度称取0.5g叶片，一串红每个梯度称取0.3g叶片。按材料与提取剂11的比例参加4下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，置于冰箱冷藏室中浸提2h，上清液即为样品提取液。(2)用移液管汲取样品提取液2ml，按表35-1参加0.2mL5%硫酸钛和0.4mL浓氨水，待沉淀构成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉
4、淀用丙酮反复洗涤35次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中参加2mol/L硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。六结果计算公式：植物组织中H2O2含量(mol/gFw)=CVtFWV?1式中C标准曲线上查得样品中H2O2浓度mol；Vt样品提取液总体积ml；V1测定时用样品提取液体积ml；FW植物组织鲜重g。七参考文献【1】邹琦.植物生理学实验指导.中国农业出版社，2020-1，(7),166-167实验2蒽酮法法测定可溶性糖(一)原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反响生成糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反响生成蓝绿色糖醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正
5、比。糖类与蒽酮反响生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm，可在此波长下进行比色，故可用于糖的定量。(二)植物材料一串红叶片和秋海棠叶片(三)仪器设备分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。(四)试剂配制1、硫酸-蒽酮溶液：24ml去离子水+76ml浓硫酸，冷却后，参加0.1g蒽酮2、浓硫酸比重1.84。3、1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80下烘至恒重，准确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，参加0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。4、100ug/L蔗糖标准液：准确汲取1%蔗糖标准液1mL参加100mL容量瓶中，加水定容。五实验步骤及
6、注意事项1标准曲线的制作:取20mL刻度试管6支，从05分别编号，按下表参加溶液、水和硫酸-蒽酮，沸水浴10min，冷却后。然后以空白为参比，在630nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。各试管加溶液和水的量2可溶性糖的提取:取新鲜植物叶片，擦净外表污物，剪碎混匀，称取0.30g秋海棠叶片、0.20g一串红叶片，各3份，分别放入6支刻度试管中，参加5-10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min提取2次，提取液过滤入20mL试管中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3直接汲取样液1ml到20ml具刻度试管，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别参
7、加4mL蒽酮硫酸溶液，沸水浴10min、显色并测定光密度630nm。由标准线性方程求出糖的量。六结果计算公式：按下面式子计算测试样品中糖含量可溶性糖含量%=CVan)(W106)式中C-标准方程求得糖量uga-汲取样品液体积mlV-提取液量mln-稀释倍数W-组织重量g七参考文献【1】邹琦.植物生理学实验指导.中国农业出版社，2020-1，(7),110-113.实验3植物细胞膜透性的测定电导仪法一原理：植物组织遭到逆境伤害时，由于膜的功能受损或构造毁坏，而使其透性增大，细胞内各种水溶性物质包括电解质将有不同程度的外渗，将组织浸入无离子水中，水的电导仪将因电解质的外渗而加大，伤害愈重，外渗愈多
8、，电导度的增加也愈大。故能够用电导仪测定外液的电导度增加值而得知伤害程度。二植物材料：一串红和海棠叶片三仪器设备：1.电导仪1台；2.真空泵(附真空枯燥器)1套；3.恒温水浴箱1个；4.30个三角瓶；5.30张封口膜；6.打孔器1把；7.10ml移液管(或定量加液器)2支；8.镊子1把；以及记号笔、去离子水、滤纸、保鲜膜、玻璃棒、吸球、洗瓶等。四试剂配制：无五实验步骤及注意事项1.容器的洗涤:2.叶片处理:将一串红叶和海棠叶片分别用自来水冲洗干净并用去离子水润洗，再用干净滤纸吸干外表水分。用68mm的打孔器避开主脉打取叶圆片(或切割成大小一致的叶块)，每个对照组5盆植物共取90个叶圆片，在每个
9、三角瓶中放入30个。3测定：在装有叶片的各三角瓶中参加100ml的去离子水，用保鲜膜封口，并用解剖针将保鲜膜扎几孔以防止叶圆片在抽气时翻出试管以便抽气。然后将试管放入真空枯燥箱中用真空泵抽气15min，抽出细胞间隙的空气，当缓缓放入空气时，水即渗入细胞间隙，叶片变成半透明状，沉入水下。将以上三角瓶在室温下保持30min，其间要屡次摇动三角瓶。4)30min后将各试管充分摇匀，用电导仪测其初电导值(S1)。5)测毕，将各试管盖塞封口，置沸水浴中10min，以杀死植物组织。取出试管后用自来水冷却至室温，并在室温下平衡10min，摇匀，测其终电导值(S2)。注意事项：1、所用的叶片叶龄要一致。2、整
10、个经过中，叶片接触的用具必须绝对干净,也不要用手接触叶片，以免污染。3、抽气要使叶片下沉才能与水分充分进行交换。4、CO2在水中的溶解度较高，测定电导时要防止高CO2气源和口中呼出CO2进入试管，以免影响结果的准确性。5、温度对溶液的电导影响很大，故S1和S2必须在一样温度下测定。六结果计算：初电导值空白电导率相对电导度100终电导值空白电导率伤害度=Lt-Lck/1-Lck100Lt:处理叶片的相对电导度Lck:对照叶片的相对电导度七参考文献【1】邹琦.植物生理学实验指导.中国农业出版社，2020-1，(7),159-160.实验四植物组织水势测定一原理：植物组织的水分状况可用水势代表水的级
11、量水平来表示。植物组织的水势愈低，则吸水能力愈强。反之，水势愈高，则吸水能力愈弱。不同植物，不同部位，不同年龄及不同时刻的组织，水势都有一定差异；土壤条件及大气条件等外界因毒对植物组织的水势也有很大影响。测定植物组织的水势能够了解植物组织的水分状况，可以作制订作物灌溉的生理指标。二植物材料：一串红和海棠叶片三仪器设备：1、水势仪；2、剪刀四实验步骤1.叶片处理:将一串红叶和海棠叶片分别用自来水冲洗干净并用去离子水润洗，再用干净滤纸吸干外表水分。用剪刀将各组叶片剪成小碎片。2测定：将各组剪碎的叶片放进仪器圆形的盒子里，进行测量。实验5植物组织游离脯氨酸含量的测定一原理植物在逆境条件下，游离脯氨酸
12、便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因而，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反响生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。二植物材料一串红叶片和秋海棠叶片三仪器设备分光光度计；水浴锅：漏斗：大试管(20m1)；具塞刻度试管(20m1)注射器或滴管(5l0ml)。四试剂配制(1)3磺基水杨酸溶液(2)甲苯；(3)2.5酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mo1.L-l磷
13、酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4下23天有效；(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100ug.mL-l。再取此液10ml，用蒸馏水稀释至lOOml，即成10gmL-1的脯氨酸标准液。五实验步骤及注意事项1标准曲线制作1取7支具塞刻度试管按表9.2-1参加各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。(2)取出冷却后向各管参加5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后汲取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色。3以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程表921各试管中试剂参加量试管编号012345
14、6脯氨酸标准溶液(m1)00.20.40.81.21.62.0水(m1)21.81.61.20.80.40冰乙酸(m1)2222222茚三酮显色液(m1)33333332.样品测定1脯氨酸提取：每个灌水梯度分别取0.3g叶片，加5mL磺基水杨酸于沸水中浸提。2取出试管，待冷却至室温后，汲取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1茚三酮显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色向各管参加5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后汲取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm下比色。六结果计算公式：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度脯氨酸含量的百分数脯氨酸g.g-1
15、(干或鲜重)=(C*V/a/W式中：C一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得：V提取液总体积mlA-测定时所汲取得体积mlW-样品重g七参考文献【1】邹琦.植物生理学实验指导.中国农业出版社，2020-1，(7),161-162实验6叶绿体色素的定量测定一原理：根据叶绿体色素提取液对可见光光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的消光度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：D=klcDk为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比
16、吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。假如溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡罗卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液注：丙酮有毒，可用下文阐述的酒精代替。在红光区的最大吸收峰分别是663nmm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别是82.04和9.27，在波长645nm下分别16.75和4
17、5.6，可根据加和性原则列出下面关系式：D663=82.04Ca+9.27CbD645=16.75Ca+45.60Cb(上式中D663、D645表示叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的消光度；Ca、Cb叶绿素a、b浓度mg/L)由上两式组成方程组解得：Ca=12.72D663-2.59D645Cb=22.88D645-4.67D663将Ca、Cb相加即得叶绿素总量CTCT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有一样的比吸光系数均为34.5，可以以在此波长下测定一次消光度D652而求出叶绿素a、b总量：CT=D5321000/
18、34.5在叶绿素存在的条件下，用分光光度计法可同时测定出溶液中的类胡罗卜素的含量。Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%的丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：Ca=12.21D663-2.81D646Cb=20.13D646-5.03D663Cxc=1000D470-3.27Ca-104Cb/229(式中Ca、Cb叶绿素a、b浓度mg/L；Cxc类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470表示叶绿素溶液在波长663nm、646nm和470nm下的消光度)由于叶绿素在不同溶剂中的吸光光谱有差异，因而，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在96
19、%的乙醇中的最大吸收峰的波长分别是665nm和649nm，类胡罗卜素为470nm95%乙醇：纯丙酮=1:1v/v的混合提取液中的最大吸收峰波长为663nm、646nm和470nm，可据此列出下面关系式：Ca=13.95D663-6.88D646Cb=24.96D646-7.32D663Cxc=1000D470-2.05Ca-114.8Cb/245二植物材料：一串红和秋海棠叶片三仪器设备：分光光度计，研钵，玻棒，25mL棕色容量瓶，小漏斗，7cm定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平四试剂配制：95%乙醇配制500mL95%乙醇：475mL无水乙醇和25mL无菌水；石英砂五实验步骤及注意事项：
20、1取一串红和秋海棠的叶片，擦净组织外表污物，剪碎去掉中脉，混匀。2每个梯度各称取0.5g秋海棠、0.3g一串红叶片，各3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2mL80丙酮，研成匀浆，再参加丙酮定容到10mL试管中。3.将这30支具刻度10ml试管放置冰箱4，浸提2h。4汲取1mL叶绿体色素提取液，加4mL70%丙酮，倒入光径1cm的比色杯内，以80丙酮为空白，在波长663nm、646nm和470nm下测定消光度。注意事项：1、研磨要在弱光下进行，且速度要快；2、研磨时要参加少量的碳酸钙，保护叶绿素；3、残渣中的色素要充分洗脱；4、波长要调准；5、比色液不能混浊。六结果计算公式：95%乙醇提取液中色素计算公式：