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1、生物化学实验指导手册实验一、考马斯亮蓝G-250【实验目的】学习、把握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质染料复合物在595nm具有很大的光吸收值，蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。本方法操作简便快速，灵敏度高，测定范围1-1000ug。【实验材料、仪器及试剂】1材料：新鲜的植物材料2仪器：722分光光度计，天平，离心机，研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗1标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml2考马斯亮蓝G-250溶液：【实验步骤】1样品的提
2、取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。2标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1参加试剂。将上面8支试管摇匀，放置5分钟后，用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。【结果计算】CVT样品中蛋白质含量ug/g.FWVSWF1000式中：C为查标准曲线值ug；VT为提取液总体积ml；VS为测定时加样量ml；WF为样品鲜重g。实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定【实验目的】学习把握鲜材料中游离氨基酸含量测定
3、的原理和方法。【实验原理】当氨基酸与水合茚三酮共热时，能定量地生成酮茚胺。该产物显示蓝紫色，称为Ruhemans紫。其最大吸收值在570nm，并在一定范围内与氨基酸含量成正比。氨基酸与茚三酮的反响分为两步进行，第一步：氨基酸被氧化构成CO2、NH3和醛，茚三酮被复原成复原型茚三酮；第二步：所构成的复原型茚三酮与另一个茚三酮分子和氨缩合生成Ruhemans紫。【实验材料，仪器及试剂】1材料：新鲜的植物材料2仪器：722分光光度计，天平，离心机，水浴锅，研钵，容量瓶，试管，移液管，三角瓶，漏斗3试剂：1水合茚三酮试剂2乙酸-乙酸钠缓冲液pH5.43标准亮氨酸标准液含氮为5ug/ml40.3%抗坏血
4、酸溶液：【实验步骤】1样品提取取新鲜植物样品0.5-1g，加5ml10%醋酸研磨，离心取上清液0.5ml，用pH5.4醋酸盐缓冲液，定容至25ml。2标准曲线的绘制：取6支20ml刻度试管，按下表进行操作。加完试剂后混匀，在沸水中煮5分钟，然后在冷水中冷却、摇匀，稀释到20毫升。用1cm光径比色杯在570nm下测定吸光度，绘制标准曲线，根据样品吸光值在标准曲线查得氨基态氮含量。【结果计算】CVT100克样品中氨基态氮含量100VSWF式中C为从标准曲线上查得的氨基态氮含量(ug)；VT为提取液总体积ml；VS为测定时加样量ml；WF为样品鲜重g实验三酶的特异性、温度、pH对酶活性的影响一酶的特
5、异性【实验原理】酶具有高度的特异性，一种酶只能催化一种化合物或某一类化合物，如淀粉酶，只能催化淀粉水解，而不能使蔗糖水解。本实验以唾液淀粉酶分别对淀粉及蔗糖的不同作用，来讲明酶的特异性。【实验试剂】1唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。20.3%NaCl的0.5%淀粉液30.5%蔗糖液4Benedict试剂A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL；B、取柠檬酸钠173g及Na2CO3无水100g，加水600mL加热使之溶解，冷后稀释至850mL；C、将A液缓慢注入B液中，混匀备用。可长期保存。【实验步骤】1
6、取试管两支，一支参加0.5%淀粉液2mL，另一支参加0.5%蔗糖液2mL；2于两支试管中各参加制备好的唾液1mL；3将两支试管同时放入37恒温水浴箱中保温；415分钟后，取出两试管，各参加Benedict试剂1mL；5将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟；6取出两试管，观察记录颜色的变化，并注意有无红色沉淀产生，为什么？二温度对酶活性的影响【实验原理】酶促反响同一般化学反响一样都需要在一定的温度下进行，使酶促反响速度最大时的温度称为此酶的最适温度，低于此温度，酶促反响速度缓慢，高于最适温度，酶蛋白变性失活。本实验以入唾液淀粉酶在不同温度下分解淀粉为例，讲明温度对酶活性的影响。【实验试剂】1唾液淀粉
7、酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。20.3%NaCl的0.5%淀粉液3KI-I溶液【实验步骤】1取三支试管并编号，同时各参加5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀；2将管1、管2、管3同时分别放入冰浴，37水浴，沸水浴中；315分钟后，取出各管，分别参加碘液数滴，观察并记录各管颜色变化，并解释此现象。三pH对酶活性的影响【实验原理】在一定条件下，酶活性最高时的pH值称为最适pH，偏离此pH，酶活性就会有所下降，不同酶的最适pH不同。例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。本实验以入唾液淀粉酶最适pH6.8在不同pH条件
8、下水解淀粉为例，讲明pH对酶活性的影响。【实验试剂】1唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。2pH1.5溶液：取0.2MNa2HPO42H2O溶液41.2mL参加0.1M柠檬酸38.8mL，然后用浓HCl调至pH1.5左右；2pH6.8溶液：取0.2MNa2HPO42H2O溶液61.8mL参加0.1M柠檬酸溶液18.2mL；3pH9.8溶液：取0.2MNa2HPO42H2O溶液77.8mL参加0.1M柠檬酸溶液2.2mL，然后用0.1NNaOH调至pH9.8。【实验步骤】1取试管3支并编号，如下表参加各试剂；23支试管同时放入37恒温水浴箱
9、内保温；315分钟后，取出3支试管，分别参加碘试剂数滴，每加1滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。实验四淀粉酶活性的测定【实验目的】本实验的目的在于把握分别测定这两种淀粉酶的方法。【实验原理】淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将3，5二硝基水杨酸复原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。【实验材料、仪器和试剂】1实验材料：萌发的小麦芽长1厘米左右2.仪器：722分光光度计，天平，离心机，水浴锅，研钵，容量瓶，试管，移液管，三角瓶，漏斗3.试剂：1淀粉溶液，
10、0.4NNaOH，PH5.6的柠檬酸缓冲液，3，5一二硝基水杨酸，麦芽糖标准液，【操作步骤】1.酶液的提取：称取2克萌发的小麦种子芽长1厘米左右,置研钵中加一克石英砂，磨成匀浆倒入50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心6000转/分钟，取上清液备用。2.a-及-淀粉酶总活性的测定：取上述酶液26毫升，放入容量瓶中，用蒸馏水稀释至100毫升稀释程度视酶活性大小而定。混合均匀后，取4支试管，2支为对照,2支为测定管，各参加稀释之酶液1毫升及1毫升Ph5.6之柠檬酸缓冲液。下面步骤重复a-淀粉酶测定的第4及5的操作，同样准备糖的测定。3.酶促反响液的制备：取4只试管标号，按下表参加试剂:反
11、响时间要准确！4.标准麦芽糖及酶水解液中麦芽糖含量的测定；按下表参加试剂将上表中试剂加完后，充分混匀，放入沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，用分光光度计在520um波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线；将酶水解液测定的消光值在麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然后进行结果计算。【结果与计算】a+-淀粉酶总活性麦芽糖毫克/鲜重克/分钟=B-B样品稀释总体积样品重克CB一(a+)-淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量B一(a+)-淀粉酶的对照管中麦芽糖量C一比色时所用样品液毫升数实验五植物材料中维生素C含量的测定染料滴定法【实验目的】本实
12、验要求学生把握染料滴定法测定维生素C的原理和方法【实验原理】维生素C在体内是一种较强的复原剂，利用染料2，6-二氯酚靛酚作氧化剂，可将复原态的维生素C氧化成脱氢维生素C，而染料本身复原成无色的衍生物。2，6-二氯酚靛酚在酸性条件下呈红色。在滴定终点之前，滴下的2，6-二氯靛酚立即被复原成无色。当溶液从无色转变成微红色时，即为滴定终点。【实验材料、仪器和试剂】1实验材料：水果或蔬菜2仪器：天平，微量滴定管，研钵，容量瓶，移液管，三角瓶，漏斗3试剂：12%草酸20.001N2，6-二氯酚靛酚钠溶液【操作步骤】1样品的处理和提取：称取4.0克新鲜样品，置研钵中，加5毫升2%草酸，研成匀浆。通过漏斗将
13、样品提取液转移到50毫升时瓶中。残渣再用2%草酸提取23次，提取液及残渣一并转入量瓶中最后以2%草酸定容。摇匀，过滤，滤液待测。2空白、样品的测定：汲取滤液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定到出现明显的粉红色在15秒内不消失为止。记录所用滴定液体积。再重复二次3测定：取2%草酸10毫升，放入别一50毫升三角瓶内，用2，6-二氯酚靛酚钠滴定到终点，记录染料用量。平行两份【结果与计算】V1V2KVX=100WV3式中：X：100克样品所含维生素C毫克数毫克/100克W：称取样品重克V1：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数V3：样品测定时所用滤液毫升数
14、即10毫升V：样品提取液稀释之总体积即50毫升K：1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出。实验六血红蛋白凝胶过滤层析【实验目的】通过本实验学习凝胶过滤层析的操作技术，把握凝胶过滤层析的原理及其应用。【实验原理】凝胶过滤gelfiltration是一种利用凝胶根据分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析molecularsievechromatography或排阻层析exclusionchromatography。1凝胶介质目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶，商品名Sephardex、琼脂糖凝胶，商品名Sepharose和聚丙烯酰胺凝胶，商品名bio-gel
15、和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状构造。以Sephardex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。实际工作中常用每克干胶吸水量mL的10倍G值表示葡聚糖凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目的，选择合适的凝胶型号。2凝胶过滤的原理凝胶过滤层析凝胶过滤是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中，然后选择
16、适当的缓冲液进行洗脱。凝胶本身是一种分子筛，凝胶颗粒有一定得孔径，它能够把待分离样品按分子大小不同进行分离，好似过筛，能够把大颗粒与小颗粒分开。但这种过筛与普通的筛子不同。凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使其充分吸收膨胀，然后装入层析柱中,参加欲分离的混合物,然后在用同一溶剂洗脱，在洗脱经过中颗粒直径接近和大于凝胶颗粒网孔直径的大分子，不能进入凝胶颗粒中的静止相，只能留在凝胶颗粒之间的流动相中，因而先流出层析柱；反之，小分子则可自由出入凝胶颗粒，因此流速慢以致最后流出柱外，进而使样品中分子大小不同的物质得到分离。本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中参加
17、FeSO2溶液，构成一个复原带，然后参加血红蛋白样品血红蛋白与高铁氰化钾的混合液。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经复原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，构成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就能够形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。3凝胶过滤的优点及用处凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物；凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反响，因此溶质回收率接近100；而且设备简单、操作方便、分离效果好、重现性强，凝胶柱可反复使用。所以，凝胶过滤常用于测定相对分子质量、脱
18、盐、蛋白质等大分子的分离纯化。【实验仪器及试剂】1仪器：层析柱Lcmx40cm、真空泵、真空枯燥器、抽滤瓶、恒温水浴2试剂：1磷酸缓冲液PH7.0：称取Na2HPO42H2O2.172g，NaH2PO42H2O1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。2Na2HPO4EDTANa2溶液：称取2.69gEDTANa2，3.56gNa2HPO42H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。340mmol/LFeSO4溶液:称取FeSO47H2O1.11g溶于100mL水中用时现配。4SephadexG255固体铁氰化钾K3FeCN66抗凝血【实验步骤】1凝胶溶胀：取10gSePhadexG25，
19、加200mL蒸馏水充分溶胀在室温下约需6小时或在沸水浴中溶胀5小时。待凝胶溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，再参加与凝胶等体积的pH7.0磷酸缓冲液，在真空枯燥器中减压除气，准备装柱。2装柱：将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，在柱内参加少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入层析柱中，同时开启螺旋夹，控制一定流速。最好连续装完凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。装柱后构成的凝胶床至少长30cm，使胶床外表保持2-3cm液层。注意：整个操作经过中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当重新装
20、住。3平衡：继续用磷酸缓冲液洗脱，调整缓冲液流速，平衡20-30分钟。4样品制备：1取1m鸡的抗凝血放入小烧杯中，加5mLpH7.0的磷酸缓冲液，再参加27.5mgK3Fe(CN)6固体,用玻棒搅动使其溶解，即得褐色的高铁血红蛋白溶液。2汲取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小烧杯中混匀。注意：复原剂混合液要新鲜配制，尽可能缩短其与空气接触的时间。5上样：旋开层析柱上端旋扭，待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶即缓冲液液面与胶床平面相切时，立即参加0.4mL上述混合液，待其进入胶床外表仅留约lmm液层时，参加0.5mL缓冲液，再当胶床外表仅留约lmm液层时，汲取0
21、.5mL血红蛋白样品溶液，小心地注入层析柱胶床面中央，注意切勿冲动胶床。渐渐打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有lmm液层时，用乳头滴管参加少量缓冲液，使剩余样品进入胶床，然后用液管小心参加35cm高的洗脱缓冲液。6洗脱：继续用磷酸缓冲液洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约6滴。7凝胶的回收：实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用或回收凝胶。【实验结果】1观察并记录实验现象。实验七过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳【实验目的】1使学生把握聚丙烯酸徽凝胶垂直板电泳的原理和操作技术；学会从植物材料小麦幼苗分离过氧化物酶同工酶。2根据酶的生物化学反响，通过染色方法显
22、示出酶的不同区带，签定小麦幼苗过氧化物酶同功酶。【实验原理】同工酶是催化同一种化学反响，但其酶蛋白本身的分子构造组成却有所不同的一组酶。同工酸与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，测定同工酶在理论上和实践上都具有重要的意义。本实验测定的过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物的光合、呼吸作用以及生长素的氧化等有关；在植物生长发育经过中它的活性不断发生变化。因而，测定过氧化物酶的生物活性或其同工酶能够了解某一时期植物体内代谢的变化。1电泳带电粒子在电场中向与其本身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。多年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生
23、产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。利用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分利率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。2电泳具有的特点但凡带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析样品量极少设备简单操作简便分辨率高便于观察、记录和保存。3聚丙烯酰胺凝胶的合成及特点聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidgelelectrophoresis,PACE是以聚丙烯酸胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体Acrylamide，Acr和交联剂N，N_甲叉双丙烯酰胺N，N一Methylenebisacrylamide，Bis)，在引发剂和
24、催化剂的作用下聚合而成的。化学聚合的引发剂是过硫酸铵Ap在构成中提供自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反响。催化剂是四甲基乙二胺Tetramethylethylenediamine,TEMED则可加快引发剂释放自由基的速度，详细反响是过硫酸铵在水溶液中构成一个过硫酸自由基，此自由基能够激活TEMED，TEMED作为一个电子载体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转换化成丙烯酰胺自由基经反响多聚物聚合成网状构造的凝胶状，其网状孔径大小由聚合条件及单体浓度决定。光聚合以核黄素即VB2作为引发剂，需要强光照射反响液和有痕量氧存在下进行。核黄素经光解构成无色基，无色基被氧再氧化成自由基
25、，进而引起聚合作用。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100毫升凝胶溶液中含有的单体Acr和交联剂Bis总克数称为凝胶浓度，用T表示。凝胶溶液中，交联剂Bis占单体Acr和交联剂Bis总量的百分数称为交联度，用C表示。改变凝胶浓度T和交联度C，可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。4聚丙烯酸胺凝胶电泳的装置电泳仪由两部分组成，即稳压稳流直流电源和缓冲液储存系统电泳槽。板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，凝胶在两块平行的玻璃板中间，因此称板状电泳slabelectrophoresis。板状电泳最大的优点是包括标准相对分子质量蛋白质在内的多个样
26、品能够在同一块凝胶上在一样的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比拟各样品的区带，保证结果的准确可靠；还能够进行双向电泳。另外，板状电泳易散热，其结果便于照相和制干胶。板状电泳槽有垂直板和水平板电泳槽。【实验材料、仪器及试剂】1材料：小麦幼苗2仪器：电泳仪一套稳压电源及圆盘电泳槽、高速冷冻离心机10000r、电冰箱、量筒、烧杯、注射器、注射针头、玻璃板2块、样品瓶、染色槽、移液管、离心管、试管架、玻璃棒等。3试剂：琼脂糖、HCl、TEMED、Tris、Acr、Bis、过硫酸铵、核黄素、甘氨酸、蔗糖溴酚蓝、联苯胺贮液配制见附表。【实验步骤】1凝胶的制备1将贮液由冰箱取出，待于室温平衡后再配
27、制工作表液。2安装玻璃板3按下表比例配制分离胶：表10-2配制分离胶比例4制板：选取洗净烘干的玻璃板垂直放入制胶玻璃架上。玻璃板底部封闭，封闭的方法根据详细条件而定。5灌分离胶：1、2号液和重蒸水放一烧杯，3号液放另一烧杯。然后小心混合两杯溶液，用长滴管取混合的溶液。沿板壁参加胶液距矮玻璃板上端2cm再加水至矮玻璃板。刚加过水可看出界面，后逐步消失，等在看出界面时，表明分离胶已聚合。再静置20-30分钟，倒出水层，正常情况10min开场聚合，应控制在30min1h内聚合完成。6浓缩胶的制备：按下表比例配制浓缩胶。表10-3配制浓缩胶比例7灌浓缩胶：将4、5、和蔗糖放在一烧杯，核黄素单放一烧杯。
28、灌胶高度约2厘米，再加上梳子，然后置日光灯下聚合20分钟，待浓缩胶变成乳白色，聚合即告完成，去掉梳子。2样品的制备称取小麦幼苗茎部0.5g，放入研钵内，加pH8.0提取液1毫升，于冰水浴中研成匀浆，然后以2毫升提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000r离心10分钟，倒出上清液，以等量40%蔗糖及1滴溴酚蓝混合，留作点样用。3点样、装槽1点样：加样前先把凝胶板旁边的密封胶条除去，请勿将凝胶板拉坏或产生气泡。用微量注射器按顺序从凝胶板顶部加样，每个凝胶孔加1520ul样品，稀溶液最多可加150200ul。加样时，微量注射器的针头伸入凝胶孔的内部,但针头不要碰到胶面，缓缓参加，因样品比重较大，因而样品