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1、* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-1实施日期制 订 人审 核 人批准人制订日期审核日期批准日期制订部门质管部分发部门检验室目的：建立微生物限度检验的标准程序。适用范围：原辅料、中间产品、成品及所有需要控制微生物限度的物料。责任：进行微生物限度检验的人员对实施该规程负责，检验室主任对本规程的有效执行承担监督检查责任。程序：1.设备及用具：微生物限度检查用设备及用具，应包括保证菌检操作的环境及各项试验所用的仪器用具等。1.1菌检操作设备 超净工作台、30一35及20一25恒温培养室（箱）、真空泵、生物学显微镜、
2、酒精灯。1.2 仪器、用具 除菌滤器、抽滤瓶、吸管、注射器、试管、量筒、烧杯、载玻片、培养皿、注射器针头、镊子、剪子、橡皮塞、橡皮管、棉花、吸管筒、接种针、工作衣、帽、口罩、鞋等。1.3 试剂1.3.1培养基： 营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）、胆盐乳糖培养基（BL）、虎红琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）、麦康凯琼脂培养基（MacC）、三糖铁琼脂培养基（TSI）、十六烷三甲基溴铵琼脂培养基、胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）、沙门氏、志贺氏菌属琼脂培养基（SS）、四硫磺酸钠亮绿增菌液（TTB）、亚碲酸盐肉汤培养基、卵黄高盐琼脂培养基、5%乳糖发酵管、甘
3、露醇高盐琼脂培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、糖、醇发酵培养基、枸橼酸盐培养基、蛋白胨水培养基、绿脓菌素（pyocyanin）测定用培养基（PDP琼脂）、赖氨酸脱羧酶* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-2试验培养基、硝酸盐胨水培养基、尿素琼脂培养基、氰化钾培养基、明胶培养基。1.3.2试药 虎红（四氯四碘荧光素）、牛肉浸出粉、沙黄（番红）、枸橼酸铁铵、DL-赖氨酸、L-赖氨酸、磷酸二氢铵、酸性复红、液体石蜡、胰蛋白胨、牛胆盐、酚红。1.3.3试液 亚碲酸钠（钾）试液、亚甲蓝试液、甲基红试液、二盐酸二甲基对苯二胺
4、试液、氢氧化钾试液、沙黄（番红）试液、虎红试液、无菌对氨基苯甲酸试液、草酸铵试液、盐酸试液、无菌尿素试液、无菌枸橼酸钠-氯化钠试液、氯化三苯四氮唑试液、a-萘酚乙醇试液、曙红钠试液、亮绿试液、氰化钾试液、靛基质试液、结晶紫试液、碘试液。1.3.4稀释剂 无菌吐温-80-氯化钠溶液、0.9%无菌氯化钠溶液、无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）。1.3.5指示液 中性红指示液、酚红指示液、溴麝香草酚蓝指示液、酸性复红指示液（Andrade指示剂）、溴甲酚紫指示液。1.3.6 消毒剂： 0.1%新洁尔灭溶液、75%酒精、2%甲酚皂液、40%甲醛。2. 试验前的准备工作2.1 用具的洗刷2.1.1试管 使用
5、过的试管经消毒后，用洗涤剂洗刷，然后用自来水冲洗4一5次，将试管倒立，内外冲洗干净，再用纯化水冲洗1次，晾干备用。2.1.2培养皿 使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出或刮出，用洗涤剂洗刷内外，再用饮用水冲洗4一5次，用纯化水洗一次，烤干或晾干备用。培养皿如被抗生素或消毒剂污染，则应在清洁液内浸泡过夜，再用饮用水冲数次，纯化水冲洗1次。2.1.3橡皮塞 先用饮用水冲洗干净，再用纯化水冲洗1次。* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-32.1.4吸管 使用过的吸管，经消毒后，用流水冲洗，冲去吸管上端的棉花（新的吸管
6、无此程序，直接浸泡），放入清洁液内浸泡过液，用饮用水冲洗数次，再用纯化水冲洗1次，晾干备用。2.1.5滤器 用饮用水冲洗数次后，再用纯化水冲洗干净。2.1.6烧杯、量筒、抽滤瓶等玻璃器皿，用饮用水冲洗数次，晾干后再用清洁液浸泡过夜，取出，用饮用水冲洗数次，纯化水冲洗1次，晾干备用。2.1.7剪刀、镊子 用水冲洗干净，放在盘内在恒温室干燥，备用。2.1.8无菌衣、裤、帽、口罩等，用水洗涤干净，配套后装入布口袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。2.2 用具的灭菌 将包扎好的用具，除另有规定外，在1210.5蒸汽灭菌30min。物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易致染菌，应
7、置温箱内加温烘干。2.3 菌检室的要求2.3.1菌检室光线应明亮，但要避免阳光直射，应有适宜的换气设备，但不得有强烈气流，防止室内空气扰动，室温最好在20-24，相对湿度保持在45%-60% 。2.3.2菌检室内设备应力求简单，除必要的设备、用具外，实验台、椅子等最好不选用木制品。2.3.3菌检室内应设置适当紫外灯及日光灯。紫外灯距实验台面一般为1.2-1.5m。2.3.4菌检室应定期全面清扫，并备有药液，菌检室的清扫工具必须专用。2.3.5工作前，菌检室（包括缓冲间）应经紫外灯照射，以达到灭菌效果，保证环境的无菌。2.3.6工作前，需用消毒药液擦拭超净工作台及工作面。工作后，用消毒药液再擦拭
8、一遍，并擦拭墙壁、地面及一切可能污染的死角。2.4 菌检室菌落检查* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-42.4.1取内径90mm的灭菌干燥培养皿，无菌操作注入已融化的冷却至约45的肉汤琼脂培养基约15ml，凝固后倒置，经30-35培养48小时，证明无菌后，取平板3一5个，分别放置工作位置的左、中、右等处，开盖暴露30min后，置30一35培养48小时，取出检查。100级洁净区（室）平板杂菌数平均不得超过1个菌落。2.4.2菌检室菌落不合要求时，应立即采取有效办法彻底消毒处理，直至重复检查合乎要求为止。2.5
9、入菌检室的要求2.5.1操作人员进入菌检室前，应在缓冲室按规定穿戴已灭菌的工作衣、帽子、口罩及鞋。一般情况下，进入菌检室后不再外出，因而每次试验所需物品应统一计划好，开始工作后不得随意出入，要求工作人员严格执行无菌制度，工作完毕将室内彻底清理，恢复使用前原状。2.5.2进入菌检室的物品、工具，需经高压蒸汽灭菌，不能高压蒸汽灭菌的，需用消毒液擦拭其外部。3.培养基3.1 根据检查的微生物不同，应选用适当的培养基。3.2 菌检用培养基的制成品应澄清、无沉淀，且需进行无菌试验：将已备妥的培养基，按其用途分别置于30一35培养48小时及20一25培养3天，均应无菌生长。如有菌生长须重新制备培养基，否则
10、不能保证无菌检查结果的可靠性。4. 操作4.1 抽样及供试品的保存4.1.1抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应抽选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品。4.1.2凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀以及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。4.1.3抽样量一般应为检验用量（2个以上最小包装单位）的三倍量。* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-54.1.4一般采用随机抽样方法抽样。4.1.5供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处（勿冷藏或冷冻），以防供试品中的
11、污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。4.1.6供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。4.2 供试品溶液的制备4.2.1液体供试品 吸供试品10ml，加入90 ml稀释剂中，混匀，作为供试液。油剂可加适量吐温-80，合剂（王浆或蜂蜜者）可用供试品作为供试液。4.2.2.固体、半固体或粘稠液 取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100 ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量吐温-80，并适当加温，但不应超过45。 a. 非水溶性供试品 称取供试品10g（10 ml），加入灭菌吐温-80（30 ml），灭菌液体
12、石蜡10 ml与0.9%无菌氯化钠溶液60 ml（或50 ml），同置匀浆仪中，乳化或其它适宜方法乳化，作为供试液，在制备过程中，必要时可适当加温，但不应超过45。 b. 不溶于水的膜剂供试品 取规定量，剪碎，加稀释剂100 ml（必要时可增加稀释剂），浸泡，振摇，作为供试液。 c. 肠溶胶囊（片）供试品 取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（PH6.8）100 ml的锥形瓶中，于45水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。4.2.3含抑菌成分供试品 供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。 a. 稀释法 将供试液种入大量的培养基中，使液体供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。 b. 离
13、心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心（每分钟3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2 ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-6先离心（每分钟500转）5分钟，取全部上清液，再行集菌处理。 c. 薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂100 ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm，孔径不大于0.450.02um微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50一100ml，取出滤膜备检。 d. 中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的
14、供试品，可用相应的供试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。5.检查法5.1. 细菌、霉菌与酵母菌检验操作规程5.1.1平皿菌落计数法 取均匀供试液，再稀释成1:102、1:103等适宜的稀释度，分别取三个稀释度的供试液各1 ml，置于平皿内，再注入约45的培养基约15 ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度作2一3个平皿。5.1.2细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用虎红琼脂培养基，酵母菌计数用浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，合剂用虎红琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。5.1.3取供试验用的稀释剂各1ml，置已灭菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养、检查，不得长菌。5.
15、1.4细菌培养时间为48小时，分别在24及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准；霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。5.1.5营养琼脂平板一般点计细菌菌落，虎红琼脂平板一般点计霉菌菌落。在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板仅点计酵母菌菌落数，液体制剂同时点计霉菌菌落及酵母菌菌落数。含蜂蜜及王浆的合剂的霉菌、酵母菌菌落数分别测定，合并计数。菌落若蔓延成片，不宜计数。5.1.6菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30一300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30一100之间的
16、稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-730一300（30一100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30一300（30一100）之间时，按下式计算两级比值： 高稀释级的平均菌落数稀释倍数 比值 = 低稀释级的平均菌落数稀释倍数 比值2时，以两稀释级的均值报告，比值2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30-300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30-300之间
17、，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级菌落数乘以稀释倍数报告； 如当1:10(或1:100)稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1：10稀释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。5.1.7培养在稀释法：取供试液（原液或1：10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置
18、培养，计数。每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得三组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。5.1.8 结果判断5.1.8.1细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌各项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。5.1.8.2细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。5.1.8.3眼科用药的霉菌（酵母菌）菌落数复试报告，须以二次复试结果均不得长菌，* * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限
19、度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-8方可判为供试品合格。5.1.8.4如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或虎红琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，应判为供试品不合格。5.1.8.5各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不合格。5.2 大肠杆菌检验操作规程5.2.1增菌培养：取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液,其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照.。培养18一2
20、4小时(必要可延至48小时)。空白对照应无菌生长。其余2份培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18一24小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于表1所列的特征，可判为未检出大肠杆菌。表1 大肠杆菌菌落形态特征培 养 基菌 落 形 态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。5.2.2分离培养：如生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的中心
21、，沾取培养物，每次应挑取2一3个疑似菌落，接种于营养琼脂培养基斜面上。置361培养18小时，供革兰氏染色镜检及生化试验用。在上述检验过程 若发现疑似的其它规定控制菌时，亦应继续鉴定。5.2.3革兰氏染色镜检：取上述斜面培养物，涂片，固定。以结晶紫染液染色1分钟，水洗。革兰氏碘液媒染1分钟，水洗，滤纸吸干余水。以95%乙醇脱色20一30秒钟，水洗。滴加沙黄染液复染1分钟，待干后镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢短杆 * * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-9菌。由于菌龄等原因，菌体长短可有变化。5.2.4 生化反应5
22、.2.4.1乳糖发酵试验：将上述斜面培养物接种于乳糖发酵管，置361培养24-48小时，观察结果。大肠杆菌应发酵乳糖并产酸产气，或产酸不产气。产酸者，以酸性复红为指示剂的培养基显红色；以溴麝香草酚蓝为指示剂的培养基显黄色，产气者，杜氏管内有气泡。为避免迟缓发酵乳糖造成假阴性，可选用5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌可于24小时内出现阳性反应。5.2.4.2 IMViC试验 靛基质试验：将斜面培养物接种于蛋白胨水培养基中，置361培养482小时。 沿管壁加入靛基质试液0.3一0.5ml，轻微摇动，观察液面颜色。阳性反应为液面呈瑰红色；阴性反应为试剂本色。 甲基红试验：将斜面培养物接种于磷
23、酸盐葡萄糖胨水培养基中，置361培养482小时。于每1ml培养液中加入甲基红指示剂1滴，立即观察结果，阳性反应培养液为鲜红色或桔红色；阴性反应呈黄色。 V一P试验：将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，置361培养482小时。于每2ml培养液中加-萘酚乙醇试液）1ml，摇匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，观察结果。阳性反应立刻或数分钟后出现红色，加试剂后4小时内，无红色反应时为阴性，如出现红色亦应判为阳性。 柠檬酸盐利用试验：将斜面培养物接种于柠檬酸盐培养基斜面，置361培养482小时。观察结果。斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝时为阳性反应；斜面无菌苔生长，培养基颜色无改
24、变为阴性反应。若斜面有微量菌苔生长或颜色改变等可疑现象时，应将待检菌株重新分离、纯化后，再行试验。 大肠杆菌的IMViC反应模式为 + + - - 或 - - + - - 。对出现可疑反应的培养物，应将所分离的待检菌株于EMB或麦康凯琼脂平板上重新划线分离后，再作生化试验证实。 * * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-105.2.4.3结果报告：当空白对照试验呈阴性，供试品检查完全符合下列结果时，判定为检出大肠杆菌。 (1)染色镜检是革兰氏阴性无芽孢杆菌。 (2)乳糖发酵产酸产气或产酸不产气。(3)IMViC试验
25、反应为 + + - - 或 - - + - - 5.3 沙门氏菌检验操作规程5.3.1增菌培养：取营养肉汤培养基3份，每份各100ml，2份分别加入供试液10ml，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18一24小时，空白对照应无菌生长。取其余2份培养液各1ml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中，培养18一24小时。5.3.2 分离培养：分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门氏、志贺氏菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，于361培养18一24小时或延至40一48小时。检查平板上有无疑似沙门氏菌落。沙门氏菌在上述平板上典型菌
26、落形态见下表：培养基菌 落 特 征DHL琼脂无色至浅橙色，半透明，多数菌株菌落中心带黑色或几乎全黑。SS琼脂无色至浅橙色，半透明或不透明，有的菌株落中心带黑褐色。EMB琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，有时中心暗色 当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于表所列特征时，可判为未检出沙门氏菌。 由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门氏菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意挑选。5.3.3初步筛选试验：如供试品平板生长的菌落特征有与表所列菌落形态特征相符或 * * * * 制 药 厂操作标准-质量
27、管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-11疑似者，以接种针轻轻接触菌落的中心部位，沾取选择平板的疑似菌落二个或更多个，划线接种于TSI琼脂斜面并穿刺底层。置361培养18一24小时观察结果。沙门氏菌在TSI琼脂斜面的反应为：斜面呈碱性（红色）底层呈酸性（黄色），硫化氢阳性（底层黑色）或阴性（无黑色）。而供试品疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门氏菌。否则，应继续做革兰氏染色、生化试验、动力检查与血清凝集试验。5.3.4 生化试验：取沙门氏菌疑似菌株的TSI斜面培养物，作以下试验：5.3.4.1靛基质试验：用接种环沾取少量培养物，接种至蛋
28、白胨水培养基中，照大肠杆菌检验方法项下操作，判断结果，沙门氏菌应为阴性反应。5.3.4.2尿素酶试验：用接种环沾取培养物，划线接种于尿素琼脂培养基斜面上，置361培养242小时。观察结果。如斜面变为红色为阳性反应，阴性反应不变色。沙门氏菌应为阴性反应。5.3.4.3氰化钾试验：取361培养20一24小时的疑似菌株营养肉汤培养液，用接种环沾取1环，接种至氰化钾培养基内，另取一环接种于对照培养基内。接种后即以橡胶塞塞紧，置361培养24一48小时，观察结果。对照管内有菌生长（混浊），试验管也有菌生长者为阳性（不受抑制），无细菌生长时为阴性（受抑制）。沙门氏菌应为阴性反应。应十分注意密封管口，夏天分
29、装培养基宜在水浴中进行以防氰化钾分散，产生氢氰酸逸出，致使氰化钾浓度下降，细菌生长，造成假阳性。5.3.4.4赖氨酸脱羧酶试验：用接种环沾取少量培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种对照培养基。置361培养24一48小时，观察结果。对照管应为黄色，试验管呈紫色时为阳性反应（赖氨酸脱羧产碱）；黄色为阴性反应。沙门氏菌为阳性反应。5.3.5 动力检查：用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂培养基管，置361培养242小时。观察结果。有动力的细菌能运动到穿刺线外呈四周扩散生长， * * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00
30、页 数16-12使培养基呈现混浊蔓延现象；无动力的细菌仅沿穿刺线生长，周围培养基清晰。无动力表现的培养物，应在室温保留2一3天后，再观察。沙门氏菌除少数例外，均具有周身鞭毛，能运动。5.3.6 血清凝集试验：在洁净载玻片近中心区的一端，以接种环沾取沙门氏菌属A一F“0”多价血清2一3环，再挑取TSI斜面上部的培养物少许，与血清混合（要小心操作，以防飞溅，污染四周），将玻片前后侧动，在暗背景下观察结果。如为阳性反应，通常在5分钟内出现凝集现象。有时反应迟缓，需将玻片置培养器内，并在皿内放湿棉球一个，以防干涸，约过20分钟，再观察结果。凡与血清出现凝集者，应以生理盐水与同一菌株培养物作对照试验。对
31、照应无凝集现象方可确定为阳性反应。当血清未出现凝集时，应以接种环取上述斜面培养物，置于含少量生理盐水的试管中，制成浓菌悬液，在100水浴中保温30分钟，待冷，再作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性反应；如不出现凝集，则为阴性反应。5.3.6 结果报告及处理：凡疑似菌株培养物生化试验及血清学试验结果按下表情况报告结果或提出进一步鉴定意见：序 血清凝集试验（A一F“0”血清）号 凝集反应10030分钟凝集反应生理盐水对照 生化反应报告及处理意见1+一符合检出沙门氏菌2一+一符合检出沙门氏菌3一一不符合未检出沙门氏菌4+一不符合进一步鉴定5一+一不符合进一步鉴定6一一符合进一步鉴定5.4 绿脓杆菌检验
32、法5.4.1增菌培养：取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18一24小时，空白对照应无菌生长。供试品如有绿脓杆菌生长，表层常呈黄绿或蓝绿色。有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取供试品2ml，用薄膜过滤 * * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-13法，过滤，并冲洗滤膜，将滤膜剪成2片，分别接种于2个100ml胆盐乳糖培养基上（与金黄色葡萄球菌同时检验时，取样4ml，过滤后剪成4片，分置于二种培养在4个中），其
33、中1个加入规定量的对照菌作阳性对照，置361培养24一48小时。5.4.2分离培养：以接种环沾取增菌培养液（如有菌膜，应挑取之），划线于十六烷三甲基 溴化铵琼脂培养基平板，置361培养18一24小时。绿脓杆菌在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上的典型菌落为扁平无定形，边缘不齐，周边 呈扩散现象，常互相融合，表面湿润，无光泽，呈灰白色。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝色。但亦有不产色素的菌株，菌落亦有粗糙型和侏儒型等。应注意挑选。性对照的平板呈阳性菌落，供试品分离平板若无菌落生长，可作出“未检出”报告。若生长，以接种针沾取2一3个疑似菌落培养物分别接种至营养琼脂培养基斜面上，置361培养1
34、8一24小时，取培养物革兰氏染色，并作氧化酶试验。5.4.3革兰氏染色镜检：取普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，革兰氏染色，镜检。绿脓杆菌为革兰氏阴性、无芽孢杆菌，菌体长短不一，可呈多形性排列，成双或短链状。本品菌体一端有1根鞭毛，以总体观察，可见活泼动力，以鞭毛染色法，可见单偏鞭毛。5.4.4 生化试验5.4.4.1氧化酶试验：取一小块白色洁净的滤纸片置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸片上，随即滴加1滴新配制的1%盐酸二甲基对苯二胺试剂，在30秒钟内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，氧化酶试验为阴性。如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆
35、菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。否 则，应进行绿脓菌素试验。5.4.4.2绿脓菌素试验：取营养琼脂斜面培养物，接种在测定绿脓菌素用的PDP琼脂斜面上，置361培养24小时后，在试管内加氯仿3一5ml，搅碎培养基并充分振摇，使培养物中的色素提取在氯仿液内。待氯仿提取液呈蓝绿色时，静置片刻，用毛细管将其移至另一试管中，并在该液中加HCl液（1mol/L）约1ml，振摇后，静 * * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-14置片刻，如在HCl液层内出现粉红色，即为阳性；无粉红色出现，为阴性反应。试验同时应有空白
36、对照试验。对阴性反应的培养物，应再接种PDP琼脂斜面，置361培养2一3天后，再行检查。上述试验结果中，绿脓菌素阴性反应的培养物，应继续进行以下试验。5.4.4.3硝酸盐还原产气试验：以接种环沾取营养琼脂斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置361培养24小时，观察结果。如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将硝酸盐分解产生氮气。5.4.4 42生长试验：以接种环挑取营养琼脂斜面培养物于无菌盐水中，制成菌悬液，然后取菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面上，立即置411水浴箱中培养24一48小时，斜面若有菌生长者为阳性；反之为阴性。5.4.4.5明胶液化试验：以接种针沾取
37、营养琼脂斜面培养物，穿刺接种于明胶培养基内，置361培养24小时，取出放冰箱内10一30分钟。如培养基仍呈溶液状，即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者，为阴性反应。5.4.5 结果报告5.4.5.1被检样品培养物经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验为阳性者，即可报告检出绿脓杆菌。5.4.5.2若氧化酶试验阳性的革兰氏阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验为阴性时，硝酸盐还原产气试验，42生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦应报告检出绿脓杆菌。5.4.5.3结果不符时，报告未检出绿脓杆菌。5.5 金黄色葡萄球菌检验法5.5.1 增菌培养：取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基3份，每份各100ml，2
38、份分别加入规定量的供试液10ml，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作为空白对照。均培养18一24小时（必要时可延至48小时）。空白对照应无菌生长。含有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取供试品2ml，用薄膜 * * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-15过滤法，过滤，并冲洗滤膜，将滤膜剪成2片，分置于2瓶100ml亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基中，与绿脓杆菌同时检验时，取样4ml，过滤后剪成4片，分置于二种增菌液4瓶中），其中1瓶加入规定量的对照菌作阳性对照试验，置361培养18一24
39、小时。若有菌生长，增菌液变混。5.5.2 分离培养：轻微摇动增菌培养液，以接种环沾取1一2环，划线接种于卵黄高盐琼脂或甘露醇高盐琼脂平板，置361培养24一72小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表中所列特征，可判为未检出金黄色葡萄球菌。 金黄色葡萄球菌菌落形态特征培养基菌 落 形 态卵黄高盐琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1一2mm甘露醇高盐琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径约0.7-1mm 若有菌落生长，并与表中所列特征相符或疑似时，以接种针轻轻接触疑似菌落中心部位沾取培养物，接种于营养琼脂斜面
40、，置361培养18一24小时。一般宜挑取2个以上疑似菌落进行革兰氏染色，并作血浆凝固酶试验。5.5.3 革兰氏染色镜检：取普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，无芽孢，无荚膜，排列呈不规则，堆积似葡萄状。5.5.4 血浆凝固酶试验：取灭菌小试管3支，各加入血浆-无菌水(1:1)0.5ml，吸取待检菌的营养肉汤培养液(或取肉汤琼脂斜面上的纯菌少许在生理盐水管中磨匀，使呈浓菌液)0.5ml，加入1支血浆管中，其余2支血浆管作对照管；1支加入阳性对照菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照，另1支加入营养肉汤或生理盐水0.5ml作空白对照。将3管同时放于
41、361培养，3小时后开始检查，以后每隔适当时间观察1次，直至24小时。检查时，轻轻将试管倾斜，仔细观察，凡空白对照 * * * * 制 药 厂操作标准-质量管理文件名称微生物限度检查标准操作规程编 码SOP-QC-070-00页 数16-16管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性反应；经保温24小时，试验管无凝固现象为阴性反应。每次试验阳性对照管应出现血浆凝固，空白对照管应不凝固。否则，应另制备血浆，重新试验。5.5.5 结果报告5.5.5.1供试品中分离培养物为革兰氏阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性，报告检出金黄色葡萄球菌。5.5.5.2不符合上述检验结果，报告未检出金黄色
42、葡萄球菌。5.6 结果判断5.6.1细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数，控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。5.6.2细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。5.6.3眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以二次复试结果均不得长菌，方可判为供试品合格。5.6.4如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或虎红琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，应判为供试品不合格。5.6.5各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不合格。