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1、DNA重组技术的基本工具(1)科学科学技术技术现代基因工程基因工程克隆技术克隆技术胚胎工程胚胎工程生态工程生态工程基本概念和基本概念和基本原理基本原理技术流程、技术流程、操作和应用操作和应用伦理问题伦理问题生物技术的生物技术的安全性与伦安全性与伦理问题理问题交流、讨论、交流、讨论、辩论辩论 细胞工程 本模块知识内容的构建顺序：本模块知识内容的构建顺序：微观微观宏观宏观中观中观专题一专题一 基因工程基因工程基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果每每100kg 100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取猪或牛的胰腺中仅可提取4 4到到5g5g。
2、1979年，美国将人的年，美国将人的胰岛素基因胰岛素基因重组到重组到大肠杆菌大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药治疗糖尿病特效药 据据WTOWTO调查：调查： 2005 2005年全世界约有糖尿病患者年全世界约有糖尿病患者1.81.8亿人，亿人，我国约我国约60006000万。万。某种药物蛋白的基因某种药物蛋白的基因烟草的烟草的DNA准确切割准确切割DNADNA的工具（的工具（“分子手术刀分子手术刀”） 限制性内切酶限制性内切酶DNADNA片段的连接工具（片段的连接工具（“分子缝合针分子缝合针”） DNADNA连接
3、酶连接酶基因转移工具（基因转移工具（“分子运输车分子运输车”） 运载体运载体 DNA DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具学习目标1、明确基因工程的原理。、明确基因工程的原理。2、举例说明基因工程的操作工具、种类和作用。、举例说明基因工程的操作工具、种类和作用。3、运用所学的、运用所学的DNA重组技术，模拟制作重组重组技术，模拟制作重组DNA分子模型。分子模型。自然界是否存在一种生物的自然界是否存在一种生物的DNADNA进入另一生物的情况？进入另一生物的情况？2.2.单细胞生物并没有在进化中灭绝，有何保护机制？单细胞生物并没有在进化中灭绝，有何保护机制？可能产生了一些特殊的酶可能产生了一
4、些特殊的酶来防范。可而这种酶能识别来防范。可而这种酶能识别外外来侵入的来侵入的DNA并将其分解，而并将其分解，而对对自身的自身的DNA不能起作用。不能起作用。“分子手术刀分子手术刀”限限制性核酸内切酶制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”2.为什么限制酶和为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分连接酶在微生物中能够分离到离到,而高等植物和动物中没有而高等植物和动物中没有?引导学生从噬引导学生从噬菌体侵染细菌菌体侵染细菌中获得灵感中获得灵感为什么限制酶不能为什么限制酶不能将自己的将自己的DNADNA分子分子剪切掉？剪切掉？1 1、DNADNA分子不具备该种限制分
5、子不具备该种限制酶的识别切割序列；酶的识别切割序列；2 2、通过甲基化酶将甲基转、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，移到所识别序列的碱基上，使了限制酶不能切开。使了限制酶不能切开。限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要来源：2.种类与命名：种类与命名：主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化 现在已经从约现在已经从约300300种微生物中分离出了约种微生物中分离出了约40004000种限制性种限制性内切酶内切酶( (限制酶限制酶) )。例如：流感嗜血杆菌的例如：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株( Haemophilus influenzae ( Haemophilus
6、influenzae d )d )中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，种限制酶，则分别命名为则分别命名为: :Hind、Hind和和Hind限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要来源：2.种类与命名：种类与命名：3.功能（特异性）功能（特异性） 识别双链识别双链DNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且核苷酸序列，并且使每条链中使每条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要来源：2.种类与命
7、名：种类与命名：3.功能（特异性）功能（特异性）4.限制酶识别序列限制酶识别序列 识别双链识别双链DNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且核苷酸序列，并且使每条链中使每条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6个核苷酸组成，个核苷酸组成，少数的识别序列由少数的识别序列由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成个核苷酸组成限制性核酸内切酶“分子手术刀”1.主要来源：主要来源：2.种类与命名：种类与命名：3.功能（特异性）功能（特异性）4.限制酶识别
8、序列限制酶识别序列5.作用结果：作用结果： 识别双链识别双链DNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且核苷酸序列，并且使每条链中使每条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6个核苷酸组成，个核苷酸组成，少数的识别序列由少数的识别序列由4 4、5 5或或8 8个核苷酸组成个核苷酸组成 被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这几
9、个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫样的切口叫黏性末端黏性末端。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端平末端平末端“分子缝合针” DNA连接酶 DNA连接酶连接酶可把黏性末端之间的缝隙可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，起来，把切下来的把切下来的DNA片段拼接成片段拼接成新的新的DNA，即将，即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键DNADNA复制复制思考：思考：“寻根问底二寻根问底二”DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚合聚合酶是一回事吗？酶是一回事吗？DNAD
10、NA聚合酶只能将聚合酶只能将单个单个核苷酸核苷酸加到已有的加到已有的单链单链核苷酸片段的末端，形核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键, ,需要摸板。需要摸板。DNADNA连接酶是连接连接酶是连接两个两个双链双链DNADNA片段片段的末端，的末端，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键, ,不需要不需要摸板。摸板。比较几种酶的作用比较几种酶的作用断开的化学键断开的化学键结果结果限制性内切酶限制性内切酶DNA酶酶DNA解旋酶解旋酶特定位置的特定位置的磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对碱基对之间的氢键之间的氢键脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA片段片段特定末端特定末端DNA单链单链全部的磷酸全部的磷酸二酯键二酯键DN
11、ADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶连接连接DNADNA链链双链双链单链单链连接部位连接部位在两在两DNADNA片片段之间形成段之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键将单个核苷酸加到将单个核苷酸加到已存在的核酸片段已存在的核酸片段的末端上，形成的末端上，形成磷磷酸二酯键酸二酯键模板模板不需要不需要需要需要DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是同一物质吗聚合酶是同一物质吗? ?聚焦二：聚焦二： “分子缝合针分子缝合针” - DNA连接连接酶酶DNADNA复制复制要让一个从甲生物细胞内取出来的要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将基因在乙生物体内进行表达，首先得将
12、这个基因送到乙生物的细胞内去。能将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是外源基因送入细胞的工具就是运载体运载体。基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”运载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载体： 细菌的质粒 噬菌体的衍生物或某些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 限制性核酸内切酶限制
13、性核酸内切酶（分子手术刀（分子手术刀) )识别双链识别双链DNADNA分子中分子中特定特定核苷酸序列，并且使每条核苷酸序列，并且使每条链中链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端功能功能来源来源结果结果DNADNA连接酶连接酶（分子缝合线（分子缝合线) )基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体（分子运输车载体（分子运输车) )功能功能种类种类种类种类条件条件对受体细胞无害。对受体细胞无害。EcoliEcoli连接酶连接酶将切下来的将切下来的DNADNA片段拼
14、接成新的片段拼接成新的DNADNA片段。片段。T T4 4 DNADNA连接酶连接酶能在受体细胞中稳定保存并大量复制。能在受体细胞中稳定保存并大量复制。有一个至多个限制酶切割位点。有一个至多个限制酶切割位点。有特殊的遗传标记基因，便于筛选。有特殊的遗传标记基因，便于筛选。质粒、动植物病毒和质粒、动植物病毒和噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物。总 结 课下制作：课下制作：使用使用EcoRI酶、酶、E.coliDNA连接酶连接酶形成的形成的DNA重组的重组的模型模型 ，下节课展示。，下节课展示。CTGCAG (1)GCCGGCTTAA GACGTCGCCGGTCA AATTC G (2) (3) (5)
15、 (6)(7)(8)CTGCAG GACGTC(1) (5) GTCA ACTGACTGGTCA (2) (7)GCCGGCCG(6)(3)（4）GCTTAAAATTC G(8)可缝合两片断，可缝合两片断，上下左右颠倒颠上下左右颠倒颠习题习题: :已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因因, ,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么么? ?请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论对照组：对照组：不添加抗不添加抗生素生素实验组实验组1 1：
16、添加一定浓添加一定浓度的四环素度的四环素实验组实验组2 2：添加一定浓添加一定浓度的氨苄青度的氨苄青霉素霉素实验组实验组3 3：添：添加一定浓度的加一定浓度的四环素和氨苄四环素和氨苄青霉素青霉素对照组对照组实验组实验组1 1实验组实验组2 2实验组实验组3 3 结结 论论预期一预期一+ + + + +既含有抗四环素基因也含既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因有抗氨苄青霉素基因预期二预期二+ + +只含有抗四环素基因只含有抗四环素基因预期三预期三+ + +只含有抗氨苄青霉素基因只含有抗氨苄青霉素基因预期四预期四+ +既不含有抗四环素基因也既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因不含有抗氨
17、苄青霉素基因质粒的构建与改造质粒的构建与改造1)1)删除不必要的删除不必要的DNADNA区域，缩小分子量，提高区域，缩小分子量，提高外源外源DNADNA片段装载量。片段装载量。2)2)灭活某些质粒的编码基因。灭活某些质粒的编码基因。3)3)加入易于识别的选择标记基因。加入易于识别的选择标记基因。 4)4)加入特殊的基因表达调控元件。加入特殊的基因表达调控元件。 一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。载体进行人工改建。 v1、关于限制
18、酶的说法中，正确的是（、关于限制酶的说法中，正确的是（ ）vA限制酶是一种酶，只识别限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序碱基序列列 vBEcoRI切割的是切割的是GA之间的氢键之间的氢键vC限制酶一般不切割自身的限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切分子，只切割外源割外源DNA vD限制酶只存在于原核生物中限制酶只存在于原核生物中练习练习2、DNA连接酶催化的反应是连接酶催化的反应是( )vADNA复制时母链与子链之间形成氢键复制时母链与子链之间形成氢键 B黏性末端碱基之间形成氢键黏性末端碱基之间形成氢键vC两个两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接片段黏性末端之间的缝隙的连接 vDA、B
19、、C都不正确都不正确3.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的的DNA片段，需使用（片段，需使用（ ）vA.同种限制酶同种限制酶 B. 两种限制酶两种限制酶vC.同种连接酶同种连接酶 D. 两种连接酶两种连接酶3、作为基因的运输工具、作为基因的运输工具载体，必须具备载体，必须具备的条件及理由是的条件及理由是( )vA能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因量复制，以便提供大量的目的基因vB具有多个限制酶切点，以便于目的基因具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达的表达vC具有某些标记基因，以便为目
20、的基因的具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件表达提供条件vD能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选便于进行筛选4.4.基因工程常用的受体细胞有（基因工程常用的受体细胞有（ ）（1 1）大肠杆菌）大肠杆菌 （2 2）枯草杆菌）枯草杆菌（3 3）支原体）支原体 （4 4）动植物细胞）动植物细胞A. A. （3 3）（）（4 4） B. B. （1 1）（）（2 2）（）（4 4）C. C. （2 2）（）（3 3）（）（4 4） D. D. （1 1）（）（2 2）（）（3 3）5 5、在受体细胞中能检测出目的基因是因为、在受体细胞中能检测出目的基因是因为( )( )A A目的基因上有标记目的基因上有标记 B B质粒具有某些标记基因质粒具有某些标记基因C C重组质粒能够复制重组质粒能够复制 D D以上都不正确以上都不正确