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1、11DNA重组技术的基本工具用1.1DNA重组技术的基本工具设想设想一一 能否培养出具有抗虫能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？性状的抗虫棉呢？ 胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的特效药是治疗糖尿病的特效药, ,长期以来只能从猪、长期以来只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低成本高。牛等动物的胰腺中提取，产量低成本高。 而微生物生长迅速，容易控制。于是科学家设想，而微生物生长迅速，容易控制。于是科学家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生物体内，并得以表若能将人的胰岛素基因导入微生物体内，并得以表达，就不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成达，就不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成本，使药品价格大幅下降。
2、本，使药品价格大幅下降。设想二设想二 能否让微生物产生出人的能否让微生物产生出人的胰岛素等珍贵药物？胰岛素等珍贵药物？这些定向改造基因的设想能实现吗？这些定向改造基因的设想能实现吗？ 经过多年的努力，科学家终于在经过多年的努力，科学家终于在2020世纪世纪7070年代创立了可以年代创立了可以定向改造定向改造生物的新技术生物的新技术 基因工程基因工程基因工程的概念基因工程的概念基因工程基因工程：指按照人们的愿望指按照人们的愿望, ,进行严格的设进行严格的设计并通过计并通过体外体外DNADNA重组重组和和转基因转基因等技术，赋予等技术，赋予生物以新的遗传特性生物以新的遗传特性, ,创造创造出更出更
3、符合人们需要符合人们需要的新的的新的生物类型生物类型和和生物产品生物产品。由于基因工程是。由于基因工程是在在DNADNA分子水平分子水平上进行设计和施工的，因此又上进行设计和施工的，因此又叫作叫作DNADNA重组技术或基因拼接技术。重组技术或基因拼接技术。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组基因工程的概念基因工程的概念基因工程培
4、育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程： 抗虫棉的培育有哪些关键步骤？抗虫棉的培育有哪些关键步骤？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提提取取抗虫基因抗虫基因普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )与运载体与运载体DNADNA拼接，导入拼接，导入棉花植株棉花植株( (有抗虫特性有抗虫特性) )表表达达 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内胞内提取出来提取出来
5、关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？具？“分子手术刀分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子缝合针分子缝合针” DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体DNA DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具1-1 DNA1-1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀” ” 限制酶限制酶 “分子缝合针分子缝合针” ” DNADNA
6、连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。主要是原核生物主要是原核生物40004000种。种。 1 1、来源：、来源： 2 2、种类：、种类：3 3、作用：、作用：5 5、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶黏性末端黏性末端平末端平末端4 4、切割方式：、切割方式： 错切和平切错切和平切
7、ATGCATGC限制酶切割磷酸二酯键限制酶切割磷酸二酯键 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A限制性内切酶作用过程限制性内切酶作用过程1 1、大肠杆菌的一种限制酶（、大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)EcoR)能识别能识别 GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开形成之间切开形成黏性黏性末端。末端。 2 2、SmaSma能识别能识别CCCGGGCCCGGG序列，并在序列，并在C C和和G G之间之间切割形成切割形成平平末端末端 。常见的两种限制酶常见的两种限制酶平末端平末端平末端平末端黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 当限制
8、酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好互补配对互补配对，这样的，这样的切口叫切口叫黏性末端黏性末端。 当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线处切中心轴线处切开时开时，切开的，切开的DNADNA两条单链的切口，是平两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫整的，这样的切口叫平末端平末端。 什么叫平末端？什么叫平末端？基因的针线：基因的针线：DNADNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A
9、T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG G C C T TT T A A A A A AA A T TT T C C G GG G C C T TT T A A A A A AA A T TT T C C G G用同种限制酶切割用同种限制酶切割ATGCATGC连接酶连接连接酶连接磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用过程：连接酶的作用过程：二、分子缝合针二、分子缝合针DNADNA连接酶连接酶作用部位：作用部位：是磷酸二酯键是磷酸二酯键（扶手）（扶手）不是氢键不是氢键（梯子）（梯子） DNADNA连接酶连接酶将两条将两条DNADNA链连接起来的酶。
10、链连接起来的酶。连接连接黏性黏性末端末端连接连接黏性黏性末端和末端和平平末端末端分类分类作用作用E.coli E.coli DNADNA连接酶连接酶连接酶种类：连接酶种类：T4DNAT4DNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶和和DNADNA连接酶有何相同点和不同点？连接酶有何相同点和不同点？DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶连接连接DNADNA链链连接部位连接部位双链双链在两在两DNADNA片断片断之间形成之间形成磷磷酸二酯键酸二酯键单链单链将将单个单个核苷酸加核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片断片断33末端形末端形成成磷酸二酯键磷酸二酯键核苷酸分子的连接：核苷酸分子的连
11、接：ATGCATGCDNADNA聚合酶连接单链聚合酶连接单链DNADNA把单个脱氧核苷酸连接到把单个脱氧核苷酸连接到DNADNA片段上片段上A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的作用聚合酶的作用返回返回三、分子运输车三、分子运输车基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的
12、细胞内去！细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具能将外源基因送入受体细胞的工具就是就是载体载体。1 1、基因工程的载体被喻为、基因工程的载体被喻为： 分子运输车分子运输车2 2、基因工程的载体来源、基因工程的载体来源：作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？质粒质粒、噬菌体噬菌体、动植物病毒动植物病毒作为载体的必要条件作为载体的必要条件 1.1.能自我复制能自我复制 能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； 2.2.有一个至多个限制酶切位点有一个至多个限制酶切位点 便于与外源目的基因结合便于与外源目的基因结
13、合 3.3.有遗传标记基因有遗传标记基因 便于检测和筛选便于检测和筛选 4.4.对受体细胞无害、易分离对受体细胞无害、易分离 安全、比较容易得到安全、比较容易得到能复制并带着插能复制并带着插入的目的基因一入的目的基因一起复制起复制有切割位点有切割位点有标记基因的存有标记基因的存在，将来可用含在，将来可用含青霉素的培养基青霉素的培养基鉴别。鉴别。认识常用的载体认识常用的载体 质粒质粒是基因工程常是基因工程常用的载体，一种裸露的、用的载体，一种裸露的、结构简单、独立于结构简单、独立于染色染色体或细菌拟核之外体或细菌拟核之外，能，能自我复制自我复制的小型环状双的小型环状双链链DNADNA分子分子，对
14、，对宿主细宿主细胞没有影响胞没有影响，主要存在，主要存在于于细菌和酵母菌细菌和酵母菌体内。体内。其中最常用的是其中最常用的是大肠杆大肠杆菌质粒菌质粒。1.1.细菌的质粒细菌的质粒2.2.噬菌体和某些病毒的噬菌体和某些病毒的DNADNA。课本知识回顾课本知识回顾 1 1、基因工程又叫做、基因工程又叫做 或或 。通俗地说，就是按照人。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种们的意愿，把一种生物的某种 提提取出来，加以取出来，加以 ， 然后放到另一种生物的细胞里然后放到另一种生物的细胞里_ 改造生物的遗传性状。改造生物的遗传性状。基因拼接技术基因拼接技术DNADNA重组技术重组技术基因基因修饰
15、改造修饰改造定向地定向地“分子手术刀分子手术刀” ” 限制酶限制酶 “分子缝合针分子缝合针” ” DNADNA连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 2 2、DNA DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具3 3、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶 主要是从主要是从_ 的一种酶。的一种酶。 识别双链识别双链DNADNA分子的某种分子的某种_ ， 并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的 _断开。形成断开。形成_和和_两种末端。两种末端。 原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列特定的
16、核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键黏性末端黏性末端平末端平末端4 4、“分子缝合针分子缝合针” DNA” DNA连接酶连接酶1 1、种类：、种类：2 2、作用部位：、作用部位：两类两类连接黏性末端连接黏性末端Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端5 5、基因进入受体细胞的载体、基因进入受体细胞的载体通常有三种通常有三种: :作为载体的条件：作为载体的条件： 在进行基因工程操作中在进行基因工程操作中, ,真正被用作载体的质粒都真正被用作载体的质粒都是在是在_ _ 的基础上进行过的基础上进行过_的
17、的 质粒质粒噬菌体衍生物噬菌体衍生物动植物病毒动植物病毒天然质粒天然质粒人工改造人工改造能自我复制；有切割位点；能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离小结基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性( (识别序列识别序列) )切开切开DNADNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNADNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶运载运载工具工具具备的具备的条件条件结构简单结构简单,
18、,大小适中大小适中能在宿主细胞中自我复制能在宿主细胞中自我复制并稳定存在并稳定存在具一个至多个限制酶切位点具一个至多个限制酶切位点具标记基因具标记基因质粒、质粒、 噬菌体衍生物、动植物病毒噬菌体衍生物、动植物病毒练习练习1.1.在基因工程中，切割运载体和含有目的在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的基因的DNADNA片段，需使用（片段，需使用（ ）A.A. 同种限制酶同种限制酶 B. B. 两种限制酶两种限制酶C.C. 同种连接酶同种连接酶 D. D. 两种连接酶两种连接酶2.2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（不属于质粒被选为基因运载体的理由是（ ）A A、能复制、能复制 B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因D D、它是环状、它是环状DNADNAD D练习练习3.3.基因工程是在基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工的。分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是步骤是 （ ） A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C练习练习