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1、重组相思子毒素B链蛋白的制备 摘要目的构建、表达和纯化相思子毒素BATB链蛋白并分析其抗原性和毒性。方法运用密码子优化软件优化ATB基因，合成目的基因亚克隆至原核载体pQE-80L构建表达质粒pQE80L-ATB，转化至E.coliM15获得表达工程菌株，并对诱导表达条件和纯化条件进行优化；通过Westernblot检测重组蛋白的抗原性；采用人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1进行重组蛋白的细胞毒性实验。结果ATB开放阅读框架全长804bp，编码268个氨基酸残基；表达工程菌株在30、1mmol/LIPTG，3h后获得包容体形式表达的目的蛋白，相对分子质量均约为30000，经N
2、i-NTA亲和层析柱纯化后纯度达97%以上，Westernblot和MTS实验结果表明，目的蛋白能特异性识别抗相思子毒素多克隆抗体且无毒性。结论重组ATB蛋白实现高表达，具有良好的抗原性，为相关疫苗研究奠定基础。 关键词相思子毒素B链；抗原性；生物恐惧相思子毒素abrintoxin，AT是来源于相思子Abrusprecatorius的一种细胞毒性蛋白，由A链ATA和B链ATB2条多肽链通过二硫键组成，其中A链呈酸性，为毒性单位；B链呈中性，为结合单位1-2，小鼠腹腔LD50约为0.04g/kg3-4。由于AT具有天然资源丰富、制备容易、中毒后无特异症状等特点，因而很容易被恐惧分子作为生物恐惧剂
3、使用4，也是我国新形势下反恐工作的重要组成部分。目前，针对毒素中毒免疫预防措施主要包括疫苗主动免疫接种1,5和应用抗体进行治疗3,62方面，由于中和性抗体只能产生短期的被动免疫保护效果，因而有效的方法是使用预防性疫苗。AT相关生防疫苗的研究较少，包括甲醛化的类毒素5和基于A链蛋白的疫苗1，但二者的使用受限于毒性问题。同时，文献报道B链亚单位同样具有很好的免疫原性7-11，而且其他相关报道显示作为AT的候选疫苗，B链亚单位具有独特的优势12。首先，如破伤风、霍乱毒素、白喉等其他的A-B家族毒素已经采用其各自的B亚单位制备疫苗并被证实是有效的；其次，由于ATB能特异性的结合到M细胞外表，因而具有佐
4、剂活性；最后，相思子毒素的B链是无毒的，因而作为疫苗应用于人体就不存在毒性的问题。本研究旨在利用原核表达系统高效表达重组ATB蛋白；分析重组蛋白的抗原性和细胞毒性，为挑选抗AT中毒的疫苗研制奠定基础。1材料与方法1.1菌株、质粒与细胞pMD18-T载体购自TaKaRa公司；含有目的基因的质粒pUC-ATB由生物公司合成；原核表达载体pQE-80L购自Qiangen公司；宿主菌E.coliDH5和M15、人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1为本实验室保存。1.2主要试剂2KODPCR反响试剂KODDNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物、DL2000核酸Marker、限制
5、性内切酶BamH、Hind、EcoR购自大连TaKaRa公司，质粒提取试剂盒为北京天根生物公司产品，5ml镍预装柱购自GEhealthcare公司，山羊抗兔IgG购自SantaCruz公司，抗天然AT兔多克隆抗体由本实验室制备，细胞毒性试验检测试剂盒购自Sigma公司，其它化学试剂为国产分析纯。1.3编码序列的优化与合成天然AT有a、b、c、d4种亚型，a亚型的细胞毒性最强，本研究选取a亚型的氨基酸序列。运用Condonopt软件，采用GenBank检索登录号1908235A优化ATB基因，并在上、下游分别含BamHI、Hind酶切位点，由南京金斯瑞公司合成，获得pUC-ATB/E.coliT
6、op10F。1.4目的基因表达载体的构建BamHI和Hind双酶切克隆测序载体pUC-ATB和表达载体pQE-80L，胶回收后在16、T4DNA连接酶条件下过夜连接，构建重组表达质粒pQE80L-ATB，连接产物转化至CaCl2法制备的E.coliM15感受态细胞中，构建重组表达菌株M15/pQE80L-ATB，PCR挑选阳性克隆，提取质粒，进行双酶切鉴定。1.5重组蛋白的诱导表达和表达形式确实定经PCR和酶切鉴定正确后，挑新鲜单菌落M15/pQE80L-ATB以1100转接于10ml的Amp抗性的LB培养基100g/ml37过夜培养。次日按1100比例转接于500ml含Amp抗性的LB液体培
7、养基，于37200r/min振摇培养34h至OD600nm为0.60.8时，加IPTG至终浓度1mmol/L，30诱导5h。8000g4离心5min收集菌体，沉淀用0.01mol/LPBS洗后重悬，于冰上超声破碎后，收集上清及沉淀。行凝胶电泳鉴定，并用考马斯亮蓝染色观察结果。1.6重组蛋白的纯化和定量按1.5方法进行扩大培养，离心收集后将沉淀用0.01mol/LPBS洗涤2次，再分别用2%Tritox-X100、2%Tween-20、1mol/LNaCl、2mol/L尿素各洗涤3次，然后参加BufferA20mmol/LPB、500mmol/LNaCl、50mmol/L咪唑，8mol/L尿素，
8、pH8.0，并上样到Ni柱中，经咪唑洗脱后收集蛋白目的峰。将收集的蛋白进行梯度透析复性，分别经4、2、1、0.5mol/L尿素和PBS缓冲液，4条件下搅拌48h以上，并用PEG20000浓缩。行SDS-PAGE电泳分析纯度，采用BCA法定量。1.7重组蛋白Westernblot分析行凝胶电泳rATB蛋白和M15/pQE80L空质粒表达的菌体蛋白，并转移至硝酸纤维素薄膜。将转好的硝酸纤维素薄膜于3%BSA封闭液中37封闭1h，用洗涤液振荡洗膜3min/次，共3次。抗天然AT兔多克隆抗体一抗，稀释度为11000室温孵育1h后洗膜3次。再用HRP标记的羊抗兔IgG二抗，稀释度为150000室温孵育1
9、h，洗膜3次后经化学发光成像系统成像。1.8重组蛋白毒性分析采用MTS试剂盒测定重组蛋白rATB和天然AT对人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1的杀伤作用。1640培养基培养人正常肺上皮细胞Beas-2B并计数为12104/孔，DMEM培养基胃黏膜细胞GES-1并计数，分别以100l/孔参加96孔板中。空白孔只加细胞培养基。375%CO2培养箱中生长24h；分别用2种培养基对测定蛋白分别为rATB或天然AT进行5倍稀释后参加100l/孔rATB的质量浓度为1000、200、400.0001ng/ml；AT的质量浓度为20、4、0.00001ng/ml，阴性对照孔不加毒素；96孔
10、板至5%CO2细胞培养箱中37，培养72h；PBS洗板3遍后96孔板依次先后参加100l培养基和20l试剂盒自带的MTS，并在37条件下培养2h；MultiskanMk3酶标仪上读取A490nm值并计算细胞生存率。2结果2.1重组质粒pQE80L-ATB的构建和鉴定优化ATB基因序列成大肠杆菌高频密码子，ATB全长786bp，编码268个氨基酸残基。用BamHI/Hind对重组质粒pQE80L-ATB进行酶切鉴定和PCR鉴定。图1结果显示成功构建了重组质粒pQE80L-ATB。2.2重组蛋白的诱导表达M5/pQE80L-ATB工程菌在沉淀中出现大量目的蛋白，相对分子质量约为30000图2a，表
11、达量约占73.43%。经Ni柱纯化，目的蛋白在含500mmol/L咪唑洗脱液中被洗脱下来图2b，纯化后的纯度为97%左右。经复性、浓缩后质量浓度约为0.832mg/ml。2.3重组蛋白的抗原性分析免疫印迹显示，纯化后的rATB蛋白能特异性的与抗天然AT兔多抗体发生反响图3，讲明目的蛋白具有特异的抗原性。2.4重组蛋白的毒性分析MTS法测定rATB对细胞毒性实验表明，rATB对人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1是无毒性的，这与文献报道相一致；同时细胞存活曲线图4表明天然AT对Beas-2B的IC50约为0.16ng/ml，图5显示GES-1的IC50约为0.032ng/ml。3
12、讨论AT是植物来源的蛋白毒素，属于型核糖体失活蛋白RIP，其毒性是普通化学武器的几百倍，是迄今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一1，发展有效的防治手段已成为各国生防领域的重要研究任务，而主动免疫是一种预防毒素中毒的有效方法。目前关于AT相关的生防疫苗研制较少。其中，类毒素是将天然毒素经甲醛化处理后能够保护免疫动物的致死剂量毒素中毒5，由于具有一定毒性而未有进一步的发展。2008年，Surendranath等3报道了一种中和性IgG单抗D6F10，能够在细胞内或小鼠体内抑制AT中毒。2011年，我室Han等1采用定点突变技术获得ATA突变体mABRAE164AR167L，能抵抗10LD50剂量的
13、天然毒素攻毒，显示出良好的免疫原性。关于毒素B链的免疫原性则存在争议，有文献报道B链的免疫原性不如A链8-10,13-16，不合适做疫苗候选。但也有研究者以为证实B链亚单位同样具有很好的免疫原性，而且其他毒素的B链蛋白已被证实是一种良好的疫苗候选抗原12。此外，B链蛋白在毒素中发挥结合链作用，因而在缺乏A链的情况下，B链蛋白是无毒性的，这也是B链蛋白疫苗优于基于A链蛋白或全毒素疫苗的优势。本研究首先应用密码子优化软件Condonopt对ATB进行基因优化，替换大肠杆菌稀有密码子为高频密码子，并成功构建原核表达载体pQE80L-ATB，重组蛋白以包容体形式存在，且相对分子质量均约为30000，采用Ni-NTA亲和层析柱纯化，蛋白纯度均达97%以上。经免疫印迹实验验证，rATB可与相应的抗天然AT兔多克隆抗体发生特异性反响，MTS细胞毒性试验结果表明rATB无毒性，这与文献报道相一致11。总之，本研究在大肠杆菌表达系统中获得rATB的高效表达，重组蛋白无毒性且保留了良好的抗原性，为下一步研究相思子B链疫苗奠定了基础。