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1、纳豆激酶稳定性探究摘要：目的：研究温度、pH、金属离子对纳豆激酶稳定性的影响。方法：采用琼脂糖纤维蛋白平板法测定活性。结果：纳豆激酶在低于40相对稳定，高于45时活性下降趋势明显，55活性完全丧失；纳豆激酶的最适pH为7.0，在6.09.0相对稳定；Mg2+、Ca2+、Na+对于NK有明显的激活作用，低浓度K+没有明显的激活或抑制作用，高浓度的K+对纳豆激酶的活性有抑制作用，Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+对NK的活性有不同的抑制作用。结论：纳豆激酶的保存温度要低于40，pH值在6.09.0的环境下，可以适当参加Mg2+、Ca2+、Na+增加NK的稳定性。关键词：纳豆
2、激酶；稳定性；纤溶活性随着社会的发展，人们生活水平日益提高，生活压力加大以及高脂肪、高热量食物摄入太多，全球心脑血管血栓性疾病的临床发病率也变的越来越高，心梗、脉管栓塞1等均为其引起的常见突发性疾病，已经严重危害着人们的生命健康。根据WHO统计每年约有300万人死于心血管疾病，而且已经开场向低龄化趋势发展，严重影响了人们的生命健康和生活质量2，估计2020年因心脑血管而死亡的人数将会到达2500万3。因而，怎样解决血栓性疾病的预防和治疗问题已经成为科学家和老百姓们关注的焦点。目前，临床上用于治疗血栓性疾病的药物主要有尿激酶、链激酶、组织性纤溶酶原激活剂等。它们均存在毒副作用大、半衰期短、不易被
3、人体吸收等缺点4。而纳豆激酶由于来源于大豆的发酵产物而具有安全无毒的特点，半衰期也长是尿激酶的19倍以上可达812h5。它是在1987年被日本学者须见洋行等6从纳豆中提取并命名的一种具有溶解血栓作用的酶制剂。纳豆激酶Nattokinase，NK是由纳豆枯草芽孢杆菌Bacillussubtillis/natto分泌产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有纤溶效应，溶解血栓作用显著6。纳豆激酶是一种分子量在2728kDa的蛋白质，其等电点PI在8.6左右。其活性中心位点在Asp-32、His-64和Ser221，与底物产生活性位点的有Ser125、Leu126及Gly1277。纳豆激酶作为预防和治疗血栓性
4、疾病药物具有安全性高、半衰期长、易于口服等优势8。由于这些优点，纳豆激酶在食品、保健品和药品开发方面具有很大的潜能。目前有胶囊9、软胶囊、片剂10、微囊11、咀嚼片12、泡腾片13、微丸14、口服液15、颗粒16等剂型。其中，胶囊、软胶囊、片剂从最早只要日本大和制药公司生产的纳豆激酶胶囊和金之纳纳豆胶囊到我国湖南贵生坊生产的纳豆素胶囊、北京龙兴生产的纳豆激酶胶囊、北京燕京中发生产的燕京牌纳豆、天津宝恒生物公司的蛋白硒纳豆胶囊以及天津百德公司生产的纳豆咀嚼片，这是一个较大的进步。微囊、微丸和口服液也已有专利发明。除了药品之外，还有十分口味的麻辣味纳豆17已有研究，纳豆酱已经出如今了人们的生活中，
5、相信不久会有更多不同口味的含有纳豆激酶的产品和食品会出如今人们的生活中和饭桌上。然而，纳豆激酶在具有专一性和高催化效率的同时也具有对酸、碱、热以及金属离子等稳定性差的特点。目前有报道温度在2518、4011、4519、5020时活性最高且稳定性最好，在5511、6018时纳豆激酶就会完全失去活性。有研究者通过在空间构造引入二硫键也没能增加其热稳定性21。除了温度之外，pH也是影响纳豆激酶稳定性的一个重要因素，原因是蛋白质在一定的pH条件下所含一定量的正电荷基团或负电基团会随着pH的变化而变化，进而对纳豆激酶的活性产生一定影响11。据文献报道纳豆激酶pH稳定范围在4.5-9.511，18-19。
6、最适pH为519、6.511、7.518。另外，金属离子对纳豆激酶的稳定性也有较大影响，据文献报道金属离子Mg2+11，22-24、Co2+24-25、Ca2+11，20，23，26、Na+11、K+22，25对纳豆激酶具有激活稳定作用，而且还发现Mg2+对纳豆激酶的激活促进作用在国内基本是没有异议，但是国外有文献报道Mg2+19对纳豆激酶具有抑制作用，也有文献报道Ca2+11，22、Co2+20，23对纳豆激酶有抑制作用，而金属离子Na+23、K+11对纳豆激酶没有明显的稳定或抑制作用；对于金属离子Cu2+11，20，22-25、Zn2+11，20，22-25、Fe2+11，20，22-25
7、、Al3+23、Mn2+23的报道多为具有抑制纳豆激酶活性作用。也有文献报道称：金属离子Fe2+对纳豆激酶并没有明显的激活或抑制作用25。也有报道指出金属离子Mn2+对纳豆激酶具有激活作用19。因而对于纳豆激酶的稳定性还需进一步的研究，为之后的保护剂挑选及剂型的制备提供根据和基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1主要仪器恒温水浴锅上海亚荣生化仪器厂，AB135-S电子天平梅特勒托利多仪器有限公司，AL204型电子天平梅特勒托利多仪器上海有限公司，TD-10002B电子天平天津天马衡基仪器有限公司，涡旋混合器赛默飞世尔科技中国有限公司，游标卡尺金华市美耐特工具有限公司，pHSJ-5pH计上海
8、仪电科学仪器股份有限公司，单道可调量移液枪赛默飞世尔热电有限公司，HH-B11-420生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司，超声波清洗机宁波新芝生物科技有限公司。1.1.2主要试剂氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锌、硫酸铜、氯化锰、氯化铝、氯化钡、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠均来自天津市风船化学试剂科技有限公司，氯化钠、柠檬酸和柠檬酸钠来自天津科密欧化学试剂有限公司，氯化亚铁来自天津博迪化工股份有限公司，PBSpH=7.2、尿激酶、纤维蛋白原、凝血酶均来自于北京索莱宝科技有限公司，琼脂糖来自上海玉博科技有限公司。1.1.3纳豆激酶由本实验室采用液体发酵生产制得。1.2实验方法1.2.1纳
9、豆激酶活力的测定参照Astrup法27制备琼脂糖纤维蛋白平板，在平板完全凝固后约1h，用6mm打孔器打孔，每孔参加10L样品放置37恒温箱中保温放置18h，测量透明圈不同三处直径取平均值求出溶圈面积，由于溶圈面积的大小和纳豆激酶的活性成线性关系，所以本实验直接采用纳豆激酶的溶圈面积大小来表示其活性大小。1.2.2温度对纳豆激酶的影响将实验室自制的纳豆激酶酶液分别于4、25、37、40、45、50、55、60、65条件下保温放置1h后，用纤维蛋白琼脂糖平板法测定其活性，测量透明圈不同三处直径取平均值求出溶圈面积，其中溶圈面积最大的为其最适保存温度。1.2.3保温时间对纳豆激酶的影响将纳豆激酶液分
10、别放置于4、25、37、40、45、50、55、60、65环境下保温，放置10h，每隔1h取样并存放于4保存，直至10h结束后利用琼脂糖纤维蛋白平板法测定活性，测量透明圈不同三处直径取平均值求出溶圈面积，以4酶液的活性为对照，确定不同温度下不同时间的活性变化。1.2.4纳豆激酶的最适pH的测定配制不同pH3.011.0的缓冲液，将配好的各缓冲溶液分别与粗酶液按11的比例混合，用琼脂糖纤维蛋白平板法测定不同pH值下的酶活，测量透明圈不同三处直径取平均值求出溶圈面积，其中溶圈面积最大的为其最适pH。缓冲液的配制：pH=3的缓冲液：移液枪分别汲取1mol/L柠檬酸18.60mL，0.1mol/L柠檬
11、酸1.40mL，混合，蒸馏水定容至20mL，涡旋混匀。pH=4的缓冲液：移液枪分别汲取1mol/L柠檬酸13.10mL，0.1mol/L柠檬酸6.90mL，混合，蒸馏水定容至20mL，涡旋混匀。pH=5的缓冲液：移液枪分别汲取1mol/L柠檬酸8.20mL，0.1mol/L柠檬酸11.80mL，混合，蒸馏水定容至20mL，涡旋混匀。pH=6的缓冲液：移液枪分别汲取0.2mol/LNa2HPO412.30mL，0.2mol/LNaH2PO487.70mL，混合，蒸馏水定容至100mL，涡旋混匀。pH=7的缓冲液：移液枪分别汲取0.2mol/LNa2HPO461.00mL，0.2mol/LNaH2
12、PO439.00mL，混合，蒸馏水定容至100mL，涡旋混匀。pH=8的缓冲液：移液枪分别汲取浓度为0.2mol/LNa2HPO494.70mL，0.2mol/LNaH2PO45.30mL，混合，蒸馏水定容至100mL，涡旋混匀。pH=9的缓冲液：移液枪分别汲取浓度为0.1mol/LNa2CO31.00mL，0.1mol/LNaHCO39.00mL，混合，蒸馏水定容至10mL，涡旋混匀。pH=10的缓冲液：移液枪分别汲取浓度为0.1mol/LNa2CO37.00mL，0.1mol/LNaHCO33.00mL，蒸馏水定容至10mL，涡旋混匀。pH=11的缓冲液：移液枪分别汲取浓度为0.1mol/
13、LNa2CO39.00mL，0.1mol/LNaHCO31.00mL，混合，蒸馏水定容至10mL，涡旋混匀。1.2.5pH对纳豆激酶稳定性的影响纳豆激酶对于pH的要求较高，过酸过碱均会影响它的活性。将“1.2.3项下配制好的不同pH值缓冲溶液分别与粗酶液按11的比例混合，4放置2h后，用琼脂糖纤维蛋白平板法测定其酶活，测量透明圈不同三处直径取平均值求出溶圈面积，其中活性最大的为其稳定pH。1.2.6不同金属离子对纳豆激酶的影响分别称取适量CaCl2、MgCl2、FeCl2、KCl、NaCl、ZnCl2、CuSO4、BaCl2、AlCl3、MnCl24H2O的盐，配制成50mmol/L的盐溶液。
14、使盐溶液与粗酶液恰当的混合，使金属离子的最终浓度分别为5、10mmol/L并以加PBS的酶溶液为对照。在4环境下静置1h后，用琼脂糖纤维蛋白平板法测定其酶活，测量透明圈不同三处直径取平均值求出溶圈面积。2.1温度对纳豆激酶的影响纳豆激酶的活性总趋势是随着温度的升高而降低，4、25、37对纳豆激酶活性的影响相对较小，45时活性下降较为明显，50时还具有一半的活性，当温度到达55时开场有白色沉淀产生，活性完全丧失，讲明白色沉淀就是纳豆激酶由于高温变性产生的。2.2保温时间对纳豆激酶的影响随着温度和保温时间的增加纳豆激酶活性呈下降的趋势，其中551h完全失去活性，50时7h内仍有活性，7h之后纳豆激
15、酶的活性由于沉淀的产生完全丧失；45酶活下降相对明显；40时纳豆激酶的活性随着保温时间的延长缓慢下降；4、25、37时随着保温时间的延长其活性变化不明显，进而讲明对于纳豆激酶的保存温度越低活性损失越少，短期内保存最好低于40，长期保存最好低于37。2.3纳豆激酶最适pH的测定由图3能够看出，纳豆激酶的最适pH为7.0；pH在3.011.0范围内，纳豆激酶的活性趋势呈现先增加后下降，pH=7.0为转折点，pH=7.0之前呈上升趋势，pH=7.0之后呈下降趋势，但pH=11.0活性略高于pH=3.0，这可能与纳豆激酶是碱性蛋白酶有关。时间的增加对纳豆激酶的活性没有影响，碱性环境下较酸性环境活性损失
16、相对较少，进而讲明对于纳豆激酶的长期保存最好在稍偏于碱性环境中，也讲明了纳豆激酶合适做成肠溶胶囊或者片剂。2.5不同金属离子对纳豆激酶的影响高、低浓度的金属离子Mg2+、Ca2+、Na+对于纳豆激酶的活性均具有明显的激活作用，低浓度较高浓度对纳豆激酶的激活作用愈加明显；低浓度的K+对纳豆激酶的活性无明显作用，而高浓度的K+却对其有抑制作用；金属离子Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+对纳豆激酶的活性均有不同程度的抑制作用，而且与高、低浓度无关，其中Fe2+、Al3+对纳豆激酶活性的抑制作用相对明显。纳豆激酶一般在不高于45时活性较为稳定，高于45时活性下降趋势明显，在50
17、保温1h仍能够保持一半的活性，55时纳豆激酶的活性完全丧失；在低于40纳豆激酶能够较长时间的保持活性，在45时纳豆激酶的活性下降明显，并随着时间的延长活性呈稳定下降趋势，507h内仍有活性，但在55保温1h活性完全失去；纳豆激酶的最适pH为7.0，在6.09.0范围内活性相对稳定；金属离子Mg2+、Ca2+和Na+对于纳豆激酶具有明显的激活作用，低浓度K+没有明显的激活或抑制作用，高浓度的K+对纳豆激酶的活性有抑制作用，而金属离子Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+无论是低浓度还是高浓度对纳豆激酶的活性都有不同的抑制作用，其中Fe2+、Al3+对纳豆激酶活性的抑制作用相对
18、明显。实验结果讲明纳豆激酶不会由于体温使其活性降低，肠溶胶囊或肠溶片是保护纳豆激酶不被胃酸毁坏的有效方法。由于纳豆激酶存在不稳定的特性，为工业化大规模生产带来了不便。目前对于提高酶稳定性的方法是通过改造其分子构造，比方通过化学手段进行构造的修饰进而改变其理化性质，或是融合其它酶的基因片断使其具有其它酶稳定的性质或是通过改变基因上的碱基顺序和组成28。刘中美等29通过定位突变找到了能够显著提高纳豆激酶热稳定的突变体P14L和N76D，但是发如今增加纳豆激酶热稳定性的同时其活性也有所下降。这是由于酶催化活性的空间构象与酶热稳定性空间构象不同的缘故，前者空间构造具有柔性而后者构造需要刚性，当其具有柔
19、性的空间构造被破环了活性也就降低了。南京农业大学研究30发现了既能提高纳豆激酶的热稳定性又会增加其活性的突变体，就是纳豆激酶的第36位氨基酸Asp被Gly替代后，纳豆激酶的热稳定性就会提高至原来的1.2倍，同时比活力也提高了16.6%，揣测热稳定的提高可能与Gly所带的电荷有关，由于带负电荷的氨基酸Asp对温度比拟敏感，高温会使其肽键水解，进而引起蛋白质空间构造的变化，而Gly所带电荷为中性比拟稳定；比活力的提高可能与Gly的电子云密度有关，带有宏大侧链的氨基酸Asp被无侧链的Gly代替后，使周边的电子云密度减小，对空间位阻的影响也减小，使底物更容易接触其活性中心，进而使活性明显增加。山东农业
20、大学31在提高纳豆激酶pH稳定性方面进行了研究，也利用定位突变法找到了5个突变体，分别是S182W、S182L、S182K、L203E和L203K，发现纳豆激酶的pH稳定性与碱基的替换有关，酸、碱性氨基酸分别有利于纳豆激酶在酸、碱性条件内保持活性稳定。从目前研究来看，通过基因手段提高纳豆激酶的稳定性具有可行性，通过对选取的纳豆激酶的基因进行优化并将其载到毕赤酵母菌中表达来提高产酶量可以实现32。这弥补了纳豆激酶作为溶栓药产量低和稳定性差的缺陷，为纳豆激酶成为新一代预防和治疗血栓药迈出了一大步，笔者相信纳豆激酶终究有一天会替代临床上治疗血栓疾病的其它药物，它在保健品和食品方面还有很大的研究和开发价值。