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1、红芪多糖HG-2含量及透明质酸测定摘要目的制备红芪多糖及建立红芪多糖的含量测定方法，并联合透明质酸水凝胶测定凝胶时间、释药量、降解及溶胀率等参数。方法采用纯化制备红芪多糖，苯酚硫酸法测定含量，并用化学改性法制备透明质酸水凝胶，将二者联合制备红芪多糖水凝胶。结果红芪多糖的含量为，水凝胶的凝胶时间为；溶胀率为；并在第天基本降解。红芪多糖水凝胶释药在第已趋于平稳，释药量为。结论选用葡萄糖作为对照品测定红芪多糖含量的方法简便、准确。红芪多糖水凝胶能够起到缓释作用，二者联用具有可行性，能够为后续动物实验提供理论根据。关键词红芪多糖；苯酚硫酸法；透明质酸水凝胶；释药红芪为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪的枯燥根
2、。具有固表止汗，补气利尿，托毒敛疮等成效。常用于治疗气虚、多汗、慢性肾炎及心脏病等疾病，效果显著。其中红芪多糖作为红芪药材的主要活性成分，具有抗自由基和抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用，由种单糖组成。水凝胶为三维网状构造胶体，具有良好的生物相容性，常应用于组织工程材料、药物缓释载体、角膜接触镜材料等，因其独特的性质，日益为科研研究及临床应用所重视。透明质酸，属酸性黏多糖，初次发现是从牛眼玻璃体中分离得到，并具有改善皮肤代谢、保湿及促进透皮吸收的作用。水凝胶是与相应交联剂交联制成，其疗效明显延长，在治疗骨关节炎、细胞增殖等方面有广泛应用与研究。该课题前期研究发现红芪多糖对骨关节炎有一定的治疗作用，
3、并且相关研究显示水凝胶对骨关节炎有一定的治疗作用，且具有缓释药物的作用。因而本试验分离纯化红芪多糖并将其包封于水凝胶中，考察其凝胶时间、溶胀率、释药量以及酶降解速率等参数，并综合以上相关参数分析其可行性，为后续大鼠骨关节炎的治疗作用提供理论根据。仪器型紫外可见分光光度计上海美普达仪器有限公司，型电子分析天平上海实验器材有限公司，型真空枯燥箱龙口市先科仪器公司，型低温高速离心机公司，冷冻枯燥机北京博医康实验仪器有限公司。试药红芪购自甘肃省陇西县首阳镇，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪的枯燥根。木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖对照品均来自上海源叶生物科技有限公司，批
4、号分别为、。过硫酸铵、四甲基乙二胺西安义信化工有限公司，其余试剂均为分析纯。红芪多糖的制备及含量测定红芪多糖的提取称取枯燥红芪药材，浸泡后倍量水煎煮次分别为，趁热抽滤提取液并浓缩至一定体积，冷却至室温，浓缩液中参加无水乙醇使其含醇量到达，放置后抽滤，取沉淀用热水溶解，离心滤过，所得滤液再次醇沉至含醇量达，室温静置。抽滤，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，待沉淀呈类白色时放入烘箱中烘干即得红芪多糖。精制红芪多糖取项下红芪多糖粉末，溶解并定容至量瓶中，采用水提醇沉使乙醇浓度到达，连续沉淀次，然后抽滤，沉淀物再用无水乙醇、丙酮洗涤至无色，使其在烘箱中烘干，即得精制红芪多糖。红芪多糖的纯化脱蛋白取红芪多
5、糖溶解并定容至量瓶中，采用法，参加同体积的正丁醇氯仿，振荡，静置分层，离心除去沉淀，上清液重复操作，直到无明显沉淀，合并上清液后醇沉。沉淀物依次用无水乙醇，丙酮洗涤至无色时，于烘箱中恒温枯燥，即得脱蛋白红芪多糖。红芪多糖的制备取凝胶充分溶胀后装柱。称取脱蛋白红芪多糖，溶解并定容至量瓶中，微孔滤膜滤过后进样。洗脱剂为蒸馏水，流速：。接样，每为个样，苯酚硫酸法跟踪检测，测定吸光度值，并绘制洗脱曲线，见图。合并主峰流出液，浓缩至一定体积，醇沉至醇浓度为，静置，抽滤，沉淀物用丙酮脱色，放置恒温枯燥箱中，即得红芪多糖。试验条件的选择最大吸收波长根据紫外分光光谱显示的吸收波长，可得最大吸收波长为。对照品取
6、一样浓度的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和红芪多糖溶液各于具塞试管中，共组。精细移取的苯酚溶液至具塞试管中，摇匀，迅速滴加浓硫酸，分别将其置于、水浴中恒温，然后再冷却至室温，分别在处测定值，双蒸水空白调零，结果见图。由图可知未将值计入图，表中讲明值变化，不同温度下各糖的值均有所变化。根据图曲线，将其根据温度分为、共个梯度，计算各部分曲线的斜率值，见表。从表中能够得出，在梯度内葡萄糖与红芪多糖其值最接近，讲明二者在此温度范围内变化趋势一致，线性关系较好，且二者下值均高于的值，因而在苯酚硫酸法测定红芪多糖的含量时，选择葡萄糖为对照品，后续水浴温度均选择。红芪多糖的含量测定葡萄糖标准曲线的绘
7、制精细称取葡萄糖对照品，蒸馏水定容至量瓶中，使其浓度为的葡萄糖储备液。精细移取上述储备液、于具塞试管中，适量补水至体积为。苯酚浓硫酸法处理样品，水浴，再冷却至室温，以同样处理的双蒸水为空白进行比色，在处分别测定对照品的值。以值为纵坐标，以对应的葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线为：，讲明多糖浓度在范围内，与值呈良好的线性关系。换算因子精细称取项下精制，蒸馏水溶解并定容至量瓶中。精细汲取该溶液于具塞试管中，补水至，根据上述条件测定值，并根据下面公式计算换算因子。以上计算公式中为称取的精制的质量；为多糖溶液中葡萄糖的浓度；为多糖的稀释倍数，计算得。含量测定精细称取红芪多糖，定容至量瓶中
8、。取该溶液于具塞试管中，补水至，按上述条件测值并计算。含量，为的浓度，为的稀释倍数，为称取的的质量。计算得红芪多糖的含量为。红芪多糖水凝胶的参数测定水凝胶的制备精细称取透明质酸钠分子量万万，去离子水充分溶解；加甲基丙烯酸酐，用的氢氧化钠调值并保持值在，反响。以上操作全部冰浴进行。然后放入冰箱搅拌。将上述反响后的溶液装于透析袋并置于水中，氯化钠溶液，超纯水，天天换水次。透析结束后装入离心管，冷冻枯燥即得甲基丙烯酸酯化的透明质酸。精细称取置于离心管中，参加蒸馏水充分溶解，参加过硫酸铵储备液，混匀，再参加四甲基乙二胺储备液，迅速混匀，凝胶后即得水凝胶。红芪多糖水凝胶的制备称取红芪多糖，定容至量瓶。精
9、细称取置于离心管中，参加红芪多糖溶液充分溶解，参加过硫酸铵储备液，混匀，再参加四甲基乙二胺储备液，迅速混匀，凝胶后即得红芪多糖水凝胶。红芪多糖水凝胶相关参数的测定凝胶时间按项下制备红芪多糖水凝胶，迅速混匀后置于水浴并开场计时。间歇性的取出离心管翻转，观察液体能否流动。离心管倒立，轻扣管壁，若其中液体不再往下流时，讲明凝胶已经构成，记录凝胶时间。结果表明：凝胶时间为。溶胀率待水凝胶凝固成胶体后，称质量为。将凝胶保持在恒温水浴溶液中，放置过夜，使其自然溶胀。从中取出水凝胶，用滤纸吸去外表溶液，并再次称质量为。溶胀率由公式计算得出：溶胀率。结果表明：水凝胶溶胀率为。红芪多糖水凝胶的释药制备红芪多糖水
10、凝胶浸泡在中，并置于恒温培养摇床中，振荡速率为。在预先选定的时间点、和，取出溶液，使用紫外可见分光光度计检测其在处的吸收强度，通过标准曲线计算溶液中红芪多糖的浓度，绘制曲线。每次取样后，溶液中都参加新配的，以维持总体积恒定。取个平行样进行测试，数据表示为平均值。释药曲线见图。由图可知，随着时间的增加，红芪多糖的释放量也在不断增加，第天红芪多糖的释药量到达，讲明水凝胶对药物起到了缓释作用。水凝胶体外酶降解速率测定通过计算水凝胶在酶作用下质量的变化而得。根据水凝胶的化学成分，配制浓度为的透明质酸酶体液中透明质酸酶的浓度约为，扩大倍。先让水凝胶在溶液中自然溶胀，然后取出称质量得。将水凝胶置于透明质酸
11、酶工作液中，天天换次溶液。根据需要，控制降解时间，、，取出凝胶，称质量得，屡次称质量直到恒定变化很小。降解速率通过公式计算得出：质量损失。水凝胶降解速率如图.结果表明：透明质酸水凝胶在第天已基本降解完全。讨论本试验采用传统的水提醇沉法得到红芪多糖，并通过脱蛋白、过葡聚糖凝胶柱等方法分离纯化得到红芪多糖，含量明显提高。在红芪多糖的制备经过中，样品预处理、柱高、洗脱流速、洗脱剂均为影响因素；如样品用微孔滤膜过滤，凝胶柱一般选择柱高与直径比为的层析柱，洗脱剂选纯水等。本试验对红芪多糖的含量测定方法进行研究，选用葡萄糖作对照品，测定其含量的方法简便、可靠。本试验进一步完善了以葡萄糖为对照计算多糖含量，
12、提高了试验的准确性，本试验考察了红芪多糖与透明质酸水凝胶结合的相关参数，为二者联用提供了理论根据，亦为后续红芪多糖的开发利用奠定基础。参考文献国家药典委员会中华人民共和国药典一部北京：中国医药科技出版社，：魏吴普等述清孙星衍，孙冯翼辑神农本草经北京：科学技术文献出版社，：王希玉，路莉，胡燕，等不同红芪多糖抗肿瘤和免疫调节作用研究中药药理与临床，：李菲，卫东锋，张俊英，等红芪多糖对人肺腺癌细胞蛋白表达图谱影响的研究中药药理与临床，：赵良功，李晓东，赵建辉，等种红芪多糖对实验性糖尿病小鼠血糖的影响中药材，：马丹，封士兰，赵良功，等红芪多糖的提取分离纯化及组成分析中国当代应用药学杂志，：陈同强，赵良功，等红芪多糖中个组分的单糖组成分析及多糖含量测定中国药学杂志，：惠和平，封士兰，赵良功，等红芪多糖的纯化及初步构造鉴定时珍国医国药，：赵峰，何薇，刘桂兰，等透明质酸水凝胶修复大鼠软骨缺损的实验研究重庆医学，：