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1、复合蛋白酶水解四棱豆条件的研究1材料与方法11材料与试剂四棱豆，产自湖南怀化地区。复合蛋白酶，主要成分是碱性蛋白酶，酶活力120U/mg，上海楷洋生物技术有限公司。药品:浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、甲醛、硼酸、硼砂、硫酸铜、硫酸钾，以上试剂均为分析纯。指示剂:甲基红溴甲酚绿混合指示剂、酚酞指示剂。12主要仪器设备PKS28型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;PGG9070型电热恒温古风电热箱，上海森信实验仪器邮箱公司;JJ2组织捣碎匀浆机，上海浦东物理光学仪器厂;HJ1型磁力加热搅拌器，江苏医疗仪器厂;PHS25型数显酸度计，杭州雷磁分析仪器厂;HSJ通风柜，深圳市嘉鸿顺实业有限公司;电炉
2、，天津市泰斯特仪器有限公司;电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司;分析天平，OHAUSCOPOATIONinSwiterland;SIEMENS冰箱，博西华家用电器有限公司。13试验方法131四棱豆蛋白质溶液的制备称取适量的四棱豆，用水浸泡24h后剥皮，按料水比17的比例参加蒸馏水，用组织捣碎机打浆3min，然后用干净的纱布过滤，将所得四棱豆蛋白质滤液在电炉上加热30min，即自制的四棱豆蛋白质溶液。待其冷却后，测定其蛋白质含量，并储存在冰箱中备用。132四棱豆蛋白质溶液的酶解取适量的蛋白质溶液，用2mol/L的NaOH和H2SO4溶液调节至试验设定的pH值，参加定量的复合蛋白酶，放入设制一定温
3、度的电热恒温水浴锅中进行反响，水解至预定时间后，将酶解液沸水浴钝化蛋白酶5min。冷却放置一段时间后再测定氨基态氮含量。133水解度的测定方法粗蛋白含量的测定:采用GB/T1558922008。氨基态氮测定:采用ZBX6603887（氨基态氮测定法）。水解度的计算方法:水解度(DH)=(游离氨基氮/总氮)100%。134酶解条件的单因素试验(1)酶用量对酶解反响的影响在pH值为60，酶解温度50，酶解时间为4h的酶解条件下，以水解度为指标，设计酶用量为1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察不同复合蛋白酶用量(以蛋白质溶液质量为基准，下同)对酶解反响的影响。(2)酶解温度对酶解反响的影响在复合
4、蛋白酶用量为5%，pH值60，酶解时间为4h的酶解条件下，设制温度分别为40、45、50、55、60，以水解度为指标，考察不同温度对酶解反响的影响。(3)酶解时间对酶解反响的影响在酶解温度为50，pH值为60和复合蛋白酶用量为5%的酶解条件下，酶解时间为1h、2h、3h、4h、5h、6h，以水解度为指标，考察不同时间对酶解反响的影响。(4)pH值对酶解反响的影响在酶解时间为5h、酶解温度为50、复合蛋白酶用量为5%的酶解条件下，设计pH值为4、5、6、7、8、9，以水解度为指标，考察不同pH值对酶解反响的影响。135复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的正交试验为了确定复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的最佳条
5、件，在单因素试验的基础上进行正交试验。选择酶解温度、pH、复合蛋白酶用量和酶解时间作为正交试验的4个因素，进行4因素3水平的正交试验，因素水平表见表1。136复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的最佳条件验证试验重复上述4因素3水平正交试验，验证复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的最佳条件能否正确。2结果与分析21四棱豆乳浊液中蛋白质的含量将四棱豆去皮以料水比17打成浆过滤，重复3次取样测定此时乳浊液的蛋白质含量。由表2可知四棱豆在以料水比为17的情况下，四棱豆乳浊液的蛋白质含量为289%。22复合蛋白酶水解四棱豆蛋白的单因素试验221酶用量对酶解反响的影响用复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质溶液时，酶用量对酶解反响有
6、很大影响。酶用量对酶解反响的试验结果见图1。从图1能够看出，当复合蛋白酶用量小于5%时，四棱豆蛋白质溶液的水解度随着复合蛋白酶用量的增加迅速增大;当复合蛋白酶用量大于5%时，四棱豆蛋白质溶液的水解度随着酶用量的增加并没有显著增大。这是由于酶量增加，酶与底物作用得更充分，提高了酶对不溶性蛋白的作用能力，随着酶量的继续增加，酶与底物的作用到达饱和，反响到达最大，即便再增加酶量，四棱豆蛋白质溶液的水解度变化也不会明显。因而，考虑到经济成本以及对资源的有效利用，复合蛋白酶用量为5%时，酶解反响效果最为理想。222酶解温度对酶解反响的影响酶解温度对复合蛋白酶活性的影响很大。随着温度的升高，酶催化反响速度
7、加快，至到达最大反响速率为止，高温时酶反响速度减小，这是酶本身由于高温变性所致。试验结果见图2。从图2能够看出，当温度为50时，四棱豆蛋白质溶液的水解度到达最高值。当低于50时，随着温度的提高，蛋白酶的酶活增加，酶对底物的作用效果加强，四棱豆蛋白质溶液的水解度随之增加;当温度高于50时，酶活性逐步降低，四棱豆蛋白质溶液的水解度降低，同时过高的温度会使酶的活性中心构造被毁坏导致酶变性，部分或全部失去催化活性，因而初步确定最适酶解温度为50。223酶解时间对酶解反响的影响酶解时间也是影响复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质溶液的重要影响因素之一。适宜的酶解时间能够有效地提高生产效率，节省成本。试验结果见图3
8、。从图3能够看出，当酶解时间小于5h时，四棱豆蛋白质溶液的水解度随着时间的增加逐步增大;当酶解时间大于5h时，四棱豆蛋白质溶液的水解度随着时间的延长变化不大。这是由于随着时间的延长，底物不断减少，酶解充分13，因而最适提取时间为5h。224pH值对酶解反响的影响同温度一样，pH值对复合蛋白酶的活性影响也很大。过酸过碱都会影响酶蛋白的构象，甚至会使酶变性失活。当pH值变化不是很剧烈时，酶虽未变性，但活力会遭到影响，进而抑制或促进酶解反响。试验结果见图4。从图4能够看出，pH值对水解度的影响较大。当pH值小于或大于70时，复合蛋白酶的活性遭到抑制，致使水解度降低。在pH值为70时，四棱豆蛋白质溶液
9、的水解度到达最大值。因而，复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质时，调节pH值为70左右时，效果最佳。23复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质最佳水解条件优化本试验选择酶解温度、pH、复合蛋白酶用量和酶解时间作为正交试验的4个因素，进行4因素3水平的正交试验，正交试验结果见表3。由表3可知，酶解试验中影响四棱豆水解效果的主次因素为:DCBA，讲明在用复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的酶解条件中，因素D即酶解时间为最重要因素;其次分别是因素C和因素B，即复合蛋白酶用量和酶解时的pH值;因素A即酶解温度为不重要因素。复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的最佳酶解优化工艺参数为A1B2C2D2，即:酶解温度为45，pH值为70，复合蛋白酶用量为5%，酶解时间为5h。24复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质最佳水解条件验证结果验证试验结果表明:在复合蛋白酶用量为5%、酶解温度45、pH值70、酶解时间5h的水解条件下，用复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质溶液获得的酶解液的水解度最高，到达1859%。故试验得出的复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的最佳水解条件具有可重复性。3结论通过在单因素试验的基础上进行4因素3水平的正交试验，确定了复合蛋白酶水解四棱豆蛋白质的最佳酶解优化工艺参数为酶解温度为45、pH值为70、复合蛋白酶用量为5%、酶解时间为5h，水解度能够到达1859%。