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1、灯刷染色体在遗传学教学中的考虑摘要:灯刷染色体是存在于除哺乳动物以外几乎所有动物雌配子减数分裂第一次分裂双线期的一种暂时性宏大转录体，因状如灯刷而得名，但在细胞遗传学三大经典染色体研究中关注度最低。它是研究减数分裂时期染色体的构造、组织形式、转录和转录经过的好材料。本文一方面对以上研究及构成机制作一扼要综述，另一方面讨论灯刷染色体可能的作用，也即从已有文献表明卵细胞核的灯刷染色体或多倍化为相关生物胚胎发育提供足够的转录产物。最后讨论将其作为一个案例用于遗传学教学的可能性，以激发学生学习遗传学的兴趣。关键词:遗传学；细胞遗传学；灯刷染色体；研究进展；遗传学教学遗传学是生命科学领域中一门兼具理论性
2、和实验性的基础性学科之一，从遗传学发展史上能够清楚地看到一系列经典的研究案例对遗传学的发展起到宏大的推动作用1，赋予遗传学新的内容，使遗传学理论不断地完善和提高，进而在更高水平指导遗传学的发展。例假如蝇和豌豆因其丰富的表型在性状遗传研究上成为经典研究案例，奠定了遗传学的初创和发展；唾腺染色体和灯刷染色体因其形体的宏大性和特异的细胞构造，促进了细胞遗传学的发展；以噬菌体为材料促进了生化和分子遗传学的发展；以大肠杆菌为材料的研究揭示了原核表达调控的机制；以拟南芥和水稻为材料解析了植物基因组的特点并促进了植物功能基因组学的研究2,3。这些案例还有很多，限于篇幅不逐一枚举。不过，关于遗传学发展史上经典
3、案例的研究和关注并不平衡。例如在细胞遗传学三大经典染色体的研究中，关于唾腺染色体和巴氏小体的研究很多，而灯刷染色体(Lampbrushchromosomes,LBCs)的关注度较低。尽管LBCs因拥有数以万计的正在转录的单位而具有了构造的宏大性，但在过去的130多年中公开发表的文献仅有350多篇。究其原因可能有四点：一是分离LBCs技术难度较大；二是所使用的仪器是显微镜，而不是时髦的微量移液器，导致学生的兴趣缺乏；三是可用分离该染色体的典型材料不易获得，多数动物材料都是各国重点保护的动物；四是可能由于侧重理论研究，无法获得足够的经费支持4。尽管如此，LBCs的研究仍然获得了令人兴奋的成绩，本文
4、拟沿着LBCs研究的踪迹，比拟系统地综述相关生物卵细胞减数分裂第一次分裂双线期染色体的构造、组织形式以及转录等相关知识。最后讨论将这一被忽视的“明星染色体案例介绍给学生，以期引导学生对LBCs研究的重视，激发他们学习和研究遗传学的热情。1灯刷染色体的研究进展1882年，Flemming首先在蝾螈Notophthalmusviridescens的卵母细胞中发现了这种构造5，十年之后，Rckert(1892)在狗鲨Chiloscylliumpunctatum卵母细胞中再次发现了Flemming所描绘的构造，由于其形如19世纪的灯刷或20世纪的试管刷而命名为灯刷染色体6。典型的LBCs本质上是存在于
5、除哺乳动物以外几乎所有动物在两栖类、鸟类和昆虫类都有很好的研究雌配子减数分裂第一次分裂双线期的一种暂时性宏大转录体,大小能够到达56mm。细胞核中每个LBCs是二价体一对同源染色体，核中有几个二价体就有几个LBCs，每个二价体包含四条染色单体，同源染色体通过穿插Chiasmata相连。它们具有独特的染色粒侧环Chromomerelateralloop构造：染色粒串联构成单体的主轴，是遗传惰性区；显著的侧环构造则为转录活性区，包括了成千上万的活性转录单元7。随着转录的进展，RNA链不断延长，外形呈“圣诞树样构造。除了在以上动物的卵细胞中发现LBCs外，在果蝇精子细胞Y染色体和植物中也有发现，比方
6、在单细胞藻类Acetabularia中发现有典型的LBCs构造8，其它所报道的植物LBCs不具有典型构造，只是一条较长的染色体，周围有绒毛状的构造。由于LBCs在普通光学显微镜下能够看到，因此它是研究基因组构造和功能的极为理想的实验材料9。1.1灯刷染色体的基本构造和细胞图在普通光学显微镜下，在外观上看每一个典型的LBCs两个同源染色体依靠几个穿插相连，它们分别由无数致密的染色质颗粒或染色粒串成线状，这些颗粒之间有染色质丝相连，在每一颗粒或染色粒处产生1到数个成对的侧环，这就构成了所谓LBCs上的“刷毛10。这些环之所以成对出现是由于姐妹染色单体之间没有任何联络造成的。利用扫描电镜或电镜技术结
7、合免疫技术对来自不同物种的LBCs进行观察，发现侧环是以纤细的染色质为轴，上面覆盖了无数的核糖核蛋白Ribonucleoprotein，RNP颗粒。由于RNP颗粒互相聚集和沿侧环轴向的卷曲会将正常状态的侧环一步一步装配构成小颗粒、颗粒球和严密块状物等更高级的侧环构造11，因此构成了光学显微镜下可见的宏大染色体。染色粒和连接它们的染色质丝构成了LBCs的轴，轴上最显著的特点就是染色粒侧环构造，某些有明显特征的侧环往往成为鉴定染色体特异性的界标Landmark，比方在两栖类中，几乎大部分灯刷染色体都有宏大的侧环，只是位置不同，所以能够区分不同的染色体；另一类是有特异构造的侧环，分为高密度侧环和块状
8、侧环，也存在于很多染色体不同位置中。轴上除了染色粒和侧环外，还有着丝粒、端粒、球体等构造。这些构造经常出如今特定染色体的固定部位，成为鉴别各条染色体的界标11。染色粒(Chromomere)是LBCs轴的主要成分。在配对的同源染色体中，染色体轴上染色粒的数目和分布大体一样，但形状不很规则。在最初构成的LBCs上，单体灯刷染色体染色粒的数目能够到达5000个以上，在光镜下染色粒大小从不可见到可见的1m。据估算，一个有尾目的两栖动物LBCs的染色粒所包含的碱基数目约510Mb，而侧环中仅有50150kb的DNA10。染色粒的数目和大小与物种和减数分裂的推进有关，也随侧环转录活性而变化。随着减数分裂
9、的推进，染色粒逐步变大，数目减少。在早期的LBCs中侧环转录活性高，这时染色粒小，数目多；随着双线期的推进，侧环因转录活性下降而回缩，染色粒相互融合最终成一条正常的分裂期染色体12。侧环(Lateralloop)是DNA活跃转录的区域，仅占整个LBCsDNA总量的0.2%0.4%，其与染色粒的边界序列有无特异性如今尚不清楚10。在两栖类中，它们的长度与C值呈正相关，平均长度为1015m，长的可达200300m，这些长的侧环具有染色体的特异性。多数侧环上只要一个转录单位，转录方向能够一样或相反，利用转录抑制子的研究发现，这些转录多数由RNApolII启动。侧环的产生并不同步，某些侧环能贯穿LBC
10、s整个发育期；有些仅在个别时期产生，失去转录活性后回缩到染色粒中。激素处理也能影响侧环的伸展和回缩，这点与果蝇的唾腺染色体的蓬突构造类似，其发生机制和意义有待进一步的研究。由于转录产物的种类、数量和堆积状态不同，在某些染色体轴的特定部位能够构成不同类型的侧环，这成为区分不同LBCs的重要界标13。LBCs的着丝粒Centromere有二种形态：一种是在某些两栖类中称为着丝粒颗粒，在鸟类中则为蛋白体Proteinbody,其大小形态与前后染色粒不易区分，另一种主要在两栖类发现，着丝粒和其两侧相邻的染色粒相互融合而成染色粒棒Chromomerebar。先前的报道表明着丝粒颗粒和染色粒棒上均无侧环，
11、近期的报道称某些鸟类的蛋白体有短的侧环产生14。关于端粒Telomere的观察主要来自鸟类，在姐妹染色单体的末端分别构成端粒环由染色单体的末端插入邻近的染色粒所致，通常情况下，端粒环是开放的，也存在一个插入一个开放的形式，其大小和长度具种的特性。两侧无侧环，鸡的端粒环含有2个转录单元15，关于LBCs着丝粒和端粒能够转录在欧洲水蛙中也得到证明，一些串联重复序列能够在该类构造中大量转录7。球体Sphereorganelles是LBCs上另一个重要标志，有染色体的特异性，相当于一般染色体的次级缢痕。其直径一般210m，一般包含24个10。以上这些构造由于在序列组成、位置、结合蛋白以及构成的高级构造
12、上具有染色体或种的差异，结合LBCs的长度差异，如今已经绘出了多种两栖类和鸟类的LBCs细胞图7；利用细菌人工染色体荧光原位杂交BACFISH技术绘制了鸡LBCs着丝粒区的精细物理图谱16，以上这些工作为利用LBCs进行基因组/杂种鉴定、精细遗传/物理图谱绘制、基因定位、转录和转录机制等研究工作奠定了基础。1.2灯刷染色体的转录与转录进程研究表明转录主要发生在LBCs的侧环上，大量的新生转录产物和相关蛋白结合，构成了光镜下可见的RNP基质。每个侧环由1数个转录单位组成，所以LBCs上单个转录单位是可视的，这使得他们成为在构造和分子水平上研究转录及其调控机制的优异材料17。侧环的类型因RNP基质
13、的大小和类型能够大致分为正常的大环型、颗粒型、球型和块状Lumpy，它们都是以30nmRNP颗粒为基础逐步装配而成，为了探明不同构造的侧环与转录活性的关联，对典型的侧环如球型侧环利用放射自显影、转录抑制子结合大分子扩散分析技术进行RNA合成的分析17，结果表明在这类侧环中，存在RNA的合成；侧环的延伸与转录活性相关，活性高的时候，侧环增大，活性降低时，侧环回缩到染色粒中；有的侧环中存在数个不同外形的转录单元，这几个转录单位的转录存在速度的差异。用RNA前体标记物作为探针进行原位杂交试验，与大环和颗粒状的侧环相比，球型侧环标记的速度和强度均较弱，揣测不同侧环可能具有相异的转录形式，这个问题有待进
14、一步说明18。已有的报道表明不同侧环的演化存在关联性，这同样可以以看作是转录后的调控。电镜实验证实了这些类型的侧环都是由30nmRNP颗粒组成的；热休克Thermicshock实验结果显示在低温处理下，趋于向高级侧环构造发展，而在高温处理下，则趋于向去凝缩方向发展；免疫实验也证实侧环形态的多样性与特异蛋白存在关联。例如在蝾螈的卵细胞中发现一个82kD核蛋白，利用单抗进行原位杂交试验表明能够和所有类型的侧环结合，但是并不同步。比方，当球状侧环被强烈标记时，大环和颗粒环不被标记，当标记出如今核质中时，所有类型的环不被标记，该结果初步证实了特异的蛋白与侧环的构造演变存在关联18。来自鸟类的实验表明，
15、侧环中一个转录单位约长140m，这些被转录的基因包括了编码基因和非编码基因。一个令人吃惊的事实是一些持家基因在LBCs的转录是被抑制的，比方在鸟类中编码18S、5.8S和28S的基因簇是没有活性的，但分布的该类基因仍然能够被RNApolII转录而不是polI19。迄今为止，在两栖类和鸟类LBCs的研究中，发现仅有少数单拷贝基因在此时转录。比方在两栖类LBCs中，已经证明细胞角蛋白Cytokeratin、核仁蛋白NO38/B23、cmyc和Eg1是转录的，并发现了它们的转录产物向核质转移20。基于DNA/RNA杂交技术的染色体涂抹技术Chromosomepaintingtechnique使大规模
16、研究LBCs的转录成为可能，利用改进的该技术BACFISH发现很多鸟类LBCs单拷贝的基因可能是转录的。但问题是BAC克隆是大片段插入，包含了单拷贝和多拷贝的信息，所以，要验证更多的单拷贝的表达需要进一步的实验。早期的生化实验证实LBCs转录的主要是非编码的串联重复序列21，进一步的调查是利用原位杂交实验证实两栖类LBCs转录的主要是一些微卫星序列。值得注意的是来自鸟类的研究结果，假如出如今侧环中的一个微卫星序列是转录的，那么侧环邻近的染色粒里面的同类微卫星串联簇是不表达的，这个结果表明存在一种未知的调控机制启动LBCs侧环中微卫星DNA的转录19。来自热带爪蟾的研究发现卵母细胞中还储存大量来
17、自LBCs转录子的稳定内含子StableintronicsequenceRNA，这些内含子一直到囊胚期都能够检测到，讲明在胚胎发育的早期可能发挥重要作用22。关于侧环上转录调控机制的研究，早期提出了“通读假讲Readthroughhy-pothesis23，该假讲以为侧环上转录起始于构造基因的启动子序列，到了该基因的终止序列后并不停留，而是继续转录下面的非编码序列，当代遗传学的研究结果否认了该假讲。结合基因组和细胞学的证据表明位于鸡LBCs侧环微卫星序列中的反转录转座子长末端重复序列LTR启动了微卫星序列的转录，这得到了很多来自两栖类实验的证实。假如这个机制是正确的，侧环的平均长度应该与活跃的
18、LTR启动子的数量呈负相关，这是今后需要说明的问题之一。初生的转录产物被与RNA成熟相关的蛋白包被，成为附着于侧环上的RNP基质，这种独特的构造为在活体条件下研究侧环转录产物的处理和机制提供了平台。来自生化的证据表明，鸟类LBCs侧环中多数RNP基质含有与RNA成熟相关的组件，如snRNPs、SC35、hnRNP和3末端处理相关因子。有些RNP基质中没有发现snRNPs组件，这可能是由于在相应的微卫星转录产物中缺少典型的剪切位点所致19。1.3灯刷染色体的作用自从发现LBCs后科学家一直试图理解发生在侧环上大量且有点随意转录的意义，很多人以为这种转录或多或少是没有意义的20。Davidson于
19、1986年提出了另一个假讲24，他以为发生在LBCs上的转录为将来卵母细胞的成熟和胚胎发育提供必要的转录产物，这一假讲越来越为科学家重视。可能存在这种情况，LBCs上的转录产物在核膜破裂前是隔离的，当核膜解体后进入了转录后的切割程序，构成两类成熟的编码和非编码RNA分子，这种现象在Masi和Johnson研究LBCs组蛋白的转录经过上所证明25。据此揣测，成熟编码蛋白质RNA分子能够用于在胚胎基因组启动表达之前，早期胚胎发育所必需蛋白质的合成。至于大量的非编码微卫星序列的命运能够用当代分子生物学的信息来解释。在后生动物中，编码微卫星序列的DNA能够转录构成dsRNA前体，成熟后产生siRNA，
20、这些siRNA是构成组成型异染色质所必需的。那么，能够揣测，在拥有LBCs的动物中，非编码微卫星序列的转录产物同样能够dsRNA前体形式储存在卵细胞中，为早期胚胎发育提供siRNA以便维持异染色质的稳定，这种假设的前提是要探明微卫星RNA产物能否出如今受精之后胚胎发育的经过中19。值得注意的是拥有典型LBCs的生物胚胎发育经过大部分时间是离体发育，这与胎生的哺乳动物在发育环境上存在宏大差异，因而，在这类生物中LBCs转录与离体后胚胎发育经过能否存在更密切的关联性是值得深化讨论的。1.4灯刷染色体的表观遗传修饰与染色质重塑通过对两栖类和鸟类灯刷染色体的深化研究，我们基本了解了其整体表观遗传的状态
21、。来自两栖类的研究发现这类染色体中包括染色粒和侧环不但缺少组蛋白H1，而且组蛋白H4都呈高度乙酰化状态，这是典型基因组DNA转录活化的特点，实验证实，乙酰化和甲基化修饰组蛋白的尾部都会导致侧环相应状态的改变19。关于对LBCs表观遗传修饰的理解一个典型的例子是来自于对6种鸟类卵母细胞LBCsZW的研究26。鸟类卵母细胞中性染色体ZW是一个仅通过着丝粒处相连的不对称二价体，Z染色体具有正常的LBCs形态，而富含重复序列的W则仅构成几个较大的染色粒，含有少量的侧环。进一步的研究发现W染色体具备了惰性染色体的特点，比方缺少乙酰化组蛋白H4，富含组蛋白H3K9和H3K27的二甲基化，几个大的染色粒都含
22、有大量的异染色质蛋白1。这些因素共同导致了W染色体在鸟类卵母细胞的发育中高度凝缩的状态19。尽管如今从整体上对LBCs的表观修饰有了一定的理解，但对该类染色体的“建立维持再凝缩的机制了解很少。一个重要的事实是在两栖类和鸟类的LBCs上，不但缺少组蛋白H1，而且也未见介入减数分裂染色质凝缩的拓朴异构酶II。另外一个在维持LBCs形态方面发挥重要作用的蛋白是染色体构造维持Structuralmaintenanceofchromosomes，SMC蛋白家族，它们介入了黏连Cohesin复合体和凝缩Condensin复合体的构成。电镜结合免疫试验证实黏连复合体主要出如今姐妹染色单体两条染色质丝构成的轴
23、上，后者主要在染色粒上发现。这讲明，这两种复合体可能对维持LBCs的染色粒侧环构造发挥重要作用27。最新的关于LBCs重建的实验来自将人类的精子注射进两栖类动物非洲爪蟾的卵母细胞中，结果发现精子染色体构成了典型的LBCs构造，这一方面讲明了两栖类动物卵母细胞中含有重塑哺乳动物非活性染色体的所有因素，另一方面也讲明哺乳动物卵母细胞染色体的失活并不是永久的遗传或表观遗传机制造成的。这个实验为进一步鉴定染色质重塑相关的顺式和反式作用因子以及解析其机制提供了研究材料9。2灯刷染色体应用于遗传学教学的现状与考虑对于遗传学内容的教授离不开优秀的案例，生命科学的飞速发展也使得这些案例的内涵得到了丰富和扩展。
24、以优秀案例开展遗传学教学工作能够将复杂的遗传学知识形象化和简单化，便于老师的讲授和学生的理解与记忆3，同样可以以使枯燥的遗传学学习变得妙趣横生。LBCs就是遗传学的一个优秀经典的案例，但在遗传学教学中出镜偏低。在作者教学所使用戴灼华等编写的（遗传学）课本中，以LBCs为案例介绍的内容很少28，仅在第二版第二章（遗传的细胞学基础）中，作为一种特殊染色体形态进行了简单介绍，一句“LBCs是在光学显微镜下直接观察并识别特殊位置上的单个基因转录活性极为理想的材料让学生对该案例充满了遐想和等待，但本书后面的遗传学内容均没有发现该案例的身影，因而开掘和使用LBCs案例应用于遗传教学有特别重要的意义。2.1
25、灯刷染色体在遗传学教学中的拓展以LBCs为案例进行相关遗传学内容教学，我们应首先根据高校遗传学的培养目的和教学目的，在学生把握了一定的细胞、生化和遗传知识的基础上，结合遗传学的进度逐步有序地加以介绍。在我所教授的遗传学课本中LBCs是作为一类特殊的染色体介绍给学生的，除了介绍了一点关于LBCs的发现和特点外，缺少愈加具体的资料。正是由于其可视性的特点，学生除了能够容易的把握其特殊染色体的特点外，可以以把握一般染色体具有的特点。其实，随着研究的深化，其涵盖的遗传学知识也越来越多，构成和维持该特殊染色体的原因也越来越清楚。我们在教学经过中是这样介绍的：关于LBCs构造的认识是随着相关技术的发展而不
26、断深化的。19世纪末发现LBCs并不偶尔，那时的科学家用光学显微镜寻找合适的染色体材料去研究减数分裂和有丝分裂；随着时代的发展，科学家发现LBCs丰富而富有特色的构造合适细胞图的绘制；电镜和扫描电镜的发明更推动了LBCs构造和染色体组织的认识，知道了更细微构造的形态，比方对侧环构造的认识，发现了侧环构造的复杂性；免疫学和电镜技术的结合，使科学家认识到侧环是由最基本的单位RNP颗粒组成的，经过一步步的装配和折叠构成了不同外形特点的侧环；分子技术、免疫技术和电镜技术的综合运用，使人们认识到侧环核蛋白体中RNA主要是微卫星序列的转录产物，但也有少量单拷贝的编码序列RNA。由此引导同学们考虑：既然LB
27、Cs的RNP基质中主要是编码非编码序列微卫星的RNA，它的作用究竟是什么呢？假如同学们已经知道了微卫星序列最终编码的siRNA介入了异染色质的构成和维持的话，自然会想到在LBCs“再凝缩阶段可能会发挥作用。关于合适进行细胞图的绘制可以以根据技术的发展逐步深化：在仅有光学显微镜的早期，只能根据大的界标如侧环、染色粒、着丝粒、端粒等进行简单的作图，用于区分不同的染色体、基因组甚至杂种；随着电镜技术的发展，对LBCs构造认识愈加细致，能够绘制愈加精细的细胞图；随着染色体涂抹技术的发展，能够将DN段定位到LBCs不同构造中，绘制愈加实用的物理图，这将为进行全基因组测序愈加全面的认识基因组特点奠定基础。
28、关于LBCs构成和维持原因的介绍能够使学生理解和把握染色质重塑方面的知识。早期在只要光学显微镜的条件下对它的认识一筹莫展，只能提出假讲；但随着免疫技术和分子生物学技术的运用，才认识到存在一些事实：LBCs中组蛋白H1缺失，H4高度乙酰化，染色粒处富含组蛋白H3K9和H3K27的二甲基化，鸟类W染色体几个大的染色粒都含有大量的异染色质蛋白1等等。其实这离完全了解其产生机制还有很远的距离。为了让学生直观地把握转录相关知识，可以以引入LBCs的相关内容。由于单个转录单位可视性的特点，所以能够直观容易地了解单个转录单位的构造、组成、长度、速率和分子互作等方面的知识。为了学生更容易地理解LBCs相关的遗
29、传学知识，开设LBCs分离和鉴定实验是值得考虑的教学内容。如今国内常用的遗传学实验教材没有这个实验，国外也少有开展。我校生命学院关于该实验正在筹划中，所以待有了一定的进展后再向同仁汇报。愈加具体的实验程序能够参照相关网站的内容。2.2以灯刷染色体为案例开展遗传学教学的优点作为除了哺乳动物以外广泛存在于昆虫、两栖类、鱼类和鸟类卵母细胞发育中一个经典的染色体构造，尽管其关注度相比于唾腺染色体和巴氏小体为低，但其研究历程和由此材料所获得的研究成就加深了人们对染色体构造、染色体组织、转录和转录经过的直观认识，促进了遗传学的发展。其作为遗传学教学案例有着不可替代的优势：1应用于遗传学实验教学时实验材料便
30、于获得，分离得到宏大、普通光学显微镜下可视的转录体拥有丰富的染色体构造信息，通过对经典染色体的分离和鉴定让学生在强烈好奇心的状态下把握染色体的基本构造和特殊生长发育时期染色体的特点，LBCs的分离和观察实验的开设，一方面能够更新陈旧的遗传学实验教学内容，另一方面经典、容易观察的染色体诱发学生强烈的好奇心，进而能够激发学生的学习兴趣并转化成学生学习遗传学知识的动力，提高学生的学习效果和学习成绩29。2LBCs的研究与遗传学发展同步，涉及到遗传学研究的多个方面。例如：首先科学家利用LBCs拥有宏大和丰富的染色体构造特点，研究了染色体的基本构造、染色体的组织、并绘制了细胞图，为不同物种基因组/杂种鉴定、精细物理图谱绘制、基因定位和克隆奠定基础；利用单个转录子光镜下可视的特点，探索了单拷贝编码基因和多拷贝非编码基因的转录和转录经过；利用其在减数分裂经过中逆向染色质重塑的特点，进行了大量包括表观遗传学染色质重塑机制的研究等等。作为一个经典案例将这些内容应用到遗传学教学中去，并指出关于LBCs的研究中大量没有解决的问题，比方LBCs染色质重塑机制和功能远未明了，我们引导学生主动探索LBCs构成的原因和功能，让学生通过查资料和实验设计去构成解决问题的思路。这种经典案例和研究型教学方法的综合运用，能够激发学生探索未知的兴趣，进而加深学生对遗传知识的把握和理解30。