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1、箭筈豌豆根瘤菌耐盐性研究箭筈豌豆是我国传统肥饲兼用的豆科绿肥作物，有关箭筈豌豆根瘤菌的研究尚属空白。为获得抗逆性强的根瘤菌菌株，在青海主产区采集样本，经分离、鉴定得到株箭筈豌豆根瘤菌。采用水培回接法，通过主成分分析挑选出株对宿主结瘤生长促进作用较强的根瘤菌。对该株根瘤菌进行了离体耐盐性评价，发现菌株最大耐盐极限值在左右，其他菌株最大耐盐极限值均在左右，并且菌株的耐盐特征呈个明显不同类型：和耐盐性最强，菌株和居中，菌株最差。进一步采用盆栽方法评价了其中株每类型株根瘤菌箭筈豌豆共生体的耐盐性，结果表明，在胁迫下接种根瘤菌植株结瘤数最多，在胁迫下种接种处理无显著差异；在和胁迫下，接种共生体株高显著大
2、于对照；在和胁迫下根瘤菌和可显著提高植株干重；在和胁迫下可显著提高植株含氮量并显著提高胁迫下的植株吸氮量；显著提高了胁迫下的植株吸氮量。综合来看，和能够作为在盐胁迫下提高箭筈豌豆生物量和含氮量的预选菌株。关键词：箭筈豌豆；根瘤菌；盐胁迫根瘤菌与豆科植物构成的固氮共生体是生物固氮中最强的体系，其固氮量约占生物固氮总量的以上，对农业生产有重要意义。共生固氮能够为宿主植物提供氮素，进而提高作物产量、改善作物品质、提高土壤氮素含量。提高豆科绿肥及饲草固氮效率，是提高鲜草产量、减少化肥用量、减缓能源压力、降低过量施用化学肥料造成的环境污染的有效途径。箭筈豌豆，又名大巢菜，豆科野豌豆属，一年生或越年生豆科
3、草本植物，性喜冷凉，不怕霜冻，且耐阴性好、再生力强。箭筈豌豆是北方冷凉地区春季以及南方地区冬季常用绿肥及饲草作物之一，但目前有关箭筈豌豆根瘤菌的研究工作少见报道，生产中还没有与箭筈豌豆匹配的根瘤菌菌剂。箭筈豌豆根瘤菌研究的欠缺，限制了箭筈豌豆作为豆科绿肥固氮潜能的发挥。土壤盐碱化是国内外普遍存在的问题。我国盐碱化耕地超过，在青海省等西北干旱半干旱地区分布面积大。土壤盐分胁迫对结瘤和固氮作用的影响在部分研究中有报道，盐分对固氮作用的不利影响通常与盐胁迫所造成的植株干重及氮含量的下降直接相关，在土壤盐分胁迫条件下对共生固氮而言最好的结果就是宿主、根瘤菌以及两者的交互经过均表现为对盐分的适应。青海地
4、区是典型的大陆性高原气候，地形复杂、地貌多样、生物种类多，是一个宏大的基因库。在青海省，箭筈豌豆种植广泛，且多与小麦、油菜轮作，不但可作绿肥，还能够刈青作饲料和收籽作种子。在青海等西北地区，土壤盐渍化也是农业面临的重大问题之一。本研究在对青海地区箭筈豌豆根瘤菌分离和初筛的基础上，对初筛获得的根瘤菌进行了耐盐性研究，为豆科绿肥饲草的应用和推广提供科学支撑。材料与方法根瘤菌菌株的采集、分离和鉴定年在青海省海东市互助土族自治县和平安区采集根瘤样本，经过分离、纯化、镜检、测序分析，获得株根瘤菌表，以这些菌株作为后期研究的供试菌株。供试箭筈豌豆选箭豌，由绿肥种质资源平台提供，国家种质资源库编号。根瘤菌结
5、瘤效果评价年月进行。根据马晓彤所述的水培方法，设个接种根瘤菌处理，个不接种对照处理，次重复。将植株放置于光照培养箱中培养光照、光照强度、有光温度；无光照、无光温度，定期更换营养液，后测定植株地上鲜重、植株有效瘤数粉红色或浅粉红色、有效瘤重等指标。水培溶液采用松本哲良营养液：，柠檬酸铁，；以上试剂分别溶于蒸馏水中，用时稀释倍。根瘤菌离体耐盐性评价年月，将在初筛中获得的株固氮效果较好的菌株用于根瘤菌耐盐性评价。设个处理浓度：，。配制相应浓度的液体培养基，并将其分装至试管中，每管，、高压蒸汽灭菌后备用。将根瘤菌转接到根瘤菌斜面培养基中，、培养；镜检以确定培养物能否被污染，然后转接到液体培养基中，、摇
6、瓶培养；将各菌液值调一致，取菌液接种于相应液体培养基中，次重复，、摇床培养；使用紫外分光光度计测定不同菌液值。液体培养基：甘露醇，酵母膏，。根瘤菌培养基：，甘露醇，酵母粉，刚果红，琼脂，。共生体耐盐性研究采用盆栽试验，年月进行。在试验基础上得到耐盐性有差异的个菌株用于本试验。设个盐浓度水平：，和，分别接种个根瘤菌菌株，同时设个不接种对照，共个处理，次重复。分别接种菌株于液体培养基中，摇瓶培养，将各菌液值调一致。选择粒大饱满的箭筈豌豆种子，浸于中，洗净，于培养皿中催芽。选择发芽一致的种子于相应菌液中浸泡不接种根瘤菌对照处理同时进行后播种于装有蛭石的盆钵中，每盆棵。每处理盆。在光照培养箱中培养光照
7、、光照强度、有光温度；无光照、无光温度，定期浇注无氮营养液。后，每处理随机分为组，分别浇灌含量为，营养液，每浇灌次；第天测定植株株高、结瘤数、干重和含氮量凯氏定氮法等指标。无氮植物营养液：，柠檬酸铁，微量元素液，微量元素液：，。数据处理相对值接种根瘤菌处理值对照值。相对值能够用来表征在离体培养条件下根瘤菌的耐盐性。采用和进行计算和统计分析。结果与分析根瘤菌结瘤效果利用水培回接法测定了个处理的有效结瘤数、有效瘤重、植株鲜重等指标。为了更客观地进行根瘤菌结瘤效果评价，采用主成分得分法进行数据处理，根据特征值大于且累计奉献率大于的原则，把测定指标转化为累计奉献率为的个主成分主成分和主成分的方差奉献率
8、分别为和，各处理得分如表所示。菌株得分最高，对促进箭筈豌豆生长结瘤效果最好；其次为菌株、和；菌株和得分最低。选择菌株、和用于下一步根瘤菌耐盐方面研究。根瘤菌耐盐性值是在波长下测定的菌液吸光度，在测定系统一样、培养体系一样的条件下，值与菌液的浓度呈正比，能够用来衡量菌液浓度。图表明，菌株、和均表现为随浓度的提高，菌液值降低，菌浓度下降，根瘤菌的生长遭到抑制，并且抑制程度随浓度增加而增加。在无盐胁迫下，菌株的值略有差异，、的值最高，的其次，、的最低。在胁迫下，的值急剧下降，明显低于其他菌株，并且菌株、的值仍然高于、。在条件下，的值进一步降低至，、的值略高于、，但菌株间差异缩小。在条件下，各处理值继
9、续降低，的值接近，但总体规律与条件下的类似；浓度超过后，菌株值接近。细菌生长率受细菌本身特性的影响较大，不同菌种其生长曲线不同。相对菌浓度相对值表征能够更为客观地反映菌株在盐胁迫下的相对耐盐性；在给定盐度胁迫下，相对菌浓度越大，讲明耐盐性越强。表能够反映出随盐胁迫程度的加强，根瘤菌相对菌浓度及其生长受抑制程度的变化趋势。在低浓度胁迫下，菌株的相对值快速下降，菌株、居中，菌株、受抑制较小，菌株、受抑制率分别为，和。在中浓度胁迫下，各菌株受抑制程度进一步增大，但总体规律与低浓度较为类似，受抑制率分别为，和。高浓度胁迫下，受抑制率分别为，和。在浓度范围内，同一种菌液值没有显著性变化；除根瘤菌外，其他
10、菌株相对值无显著性差异。综上，供试菌株在离体耐盐性上综合表现出明显的个类型，即菌株和随浓度的增加，相对值下降较缓，表现出较强的耐盐性，菌株和居中，菌株最差。根瘤菌箭筈豌豆共生体耐盐性选择上述个类型中的各株根瘤菌，即、和用于根瘤菌箭筈豌豆共生体耐盐性盆栽试验。浓度对箭筈豌豆结瘤数的影响接种株根瘤菌处理都能增加箭筈豌豆植株根部结瘤数，结瘤数随根瘤菌种类和胁迫强度的不同而不同图。同时，图表明随着盐胁迫程度的加强，种共生体结瘤数表现出减少的趋势。在无盐胁迫和胁迫下，接种结瘤数最多，接种结瘤数最少；在胁迫下，接种结瘤数最多，接种结瘤数最少。可见，根瘤菌在低盐胁迫下促结瘤能力较强；在高盐胁迫下有促结瘤的趋
11、势。浓度对箭筈豌豆株高的影响由图可知，各根瘤菌箭筈豌豆共生体株高随盐胁迫程度的加强而降低。在无盐胁迫下，接种共生体株高显著大于对照；接种和与对照相比没有显著性差异；在和胁迫下，接种共生体株高显著大于对照。浓度对共生体干生物量的影响如图所示，不同共生体干重随胁迫程度的加强而降低。在无盐胁迫下，和共生体干重显著高于对照，分别比对照提高了和，其中达极显著水平；在胁迫下，和共生体干重分别比对照高和，并且差异到达极显著水平；在胁迫下，种接种处理对提高植株干重都没有显著效果。浓度对箭筈豌豆含氮量和吸氮量的影响如图所示，箭筈豌豆含氮量随着盐胁迫程度的加强表现出降低的趋势。在无盐胁迫和胁迫下，接种对提高植株含
12、氮量都有极显著效果，比对照分别提高了和，接种其他菌株对提高植株含氮量没有显著效果。在胁迫下，接种、和能使植株含氮量提高，和。可见，在试验条件下，对提高盐胁迫下箭筈豌豆含氮量效果最好。在没有外源氮素供给的情况下，植株吸氮量的高低反映了根瘤菌豆科植物共生体利用空气中游离态氮合成铵态氮并为植物体利用的能力。由图可知，在无盐胁迫和胁迫下接种和对提高植株吸氮量都有显著效果，分别比对照提高，和，。在胁迫下，各接种处理与不接种相比，植株吸氮量没有显著差异。回接结瘤试验是确定共生固氮根瘤菌比拟可靠的方法。从豆科植株根瘤中分离获得的菌株只要在原寄主根部结瘤才能确定该菌为具有结瘤固氮能力的根瘤菌。水培试验作为简便
13、、直观、有效的方法被用于根瘤菌与宿主匹配性研究中。马晓彤采用水培法初筛获得了几株与不同苜蓿品种匹配的根瘤菌；管凤贞等采用水培法和盆栽法挑选出对紫云英有较好结瘤固氮效果的根瘤菌。本研究通过水培回接结瘤试验从株根瘤菌中初筛出株与箭筈豌豆共生并且结瘤效果较好的根瘤菌。本试验结果，在不同程度盐胁迫下，根瘤菌耐盐性表现强弱不同，比方在胁迫下菌株和耐盐性最强，在胁迫下菌株耐盐性最强，在胁迫下菌株耐盐性最强。这可能与细菌在不同盐胁迫下体内积累亲和性溶质氨基酸及衍生物等来保持细胞内外的浸透压平衡的能力不同有关，可以能与诱导菌体耐盐相关基因编码氨基酸合成基因等表达的盐浓度高低不同有关。此外，在范围内，菌液值没有
14、明显波动，这与郭丽琢等研究的豌豆根瘤菌在浓度下菌液值变化趋势一致，讲明在超过一定程度盐胁迫下根瘤菌几乎遭到完全抑制而没有明显的增殖。分离挑选获得的耐盐根瘤菌能否与其寄主构成较好的共生关系，是科研工作者关注的问题，因而有必要在盐胁迫条件下对根瘤菌进行盆栽回接试验。本研究中，盆栽试验所用营养液为无氮营养液，接种菌株和能使共生体氮含量增加。这些氮是根瘤菌在宿主根部构成的根瘤将空气中游离态氮在固氮酶的作用下转化为铵态氮供宿主植物利用的结果。根瘤菌与植株互作能加强共生体抗逆性。杨培志研究表明，接种根瘤菌的苜蓿抗非生物胁迫的能力可能来源于三方面：根瘤菌的固氮作用、根瘤菌与苜蓿的共生免疫作用、根瘤菌固氮对植
15、株本身组成变化或其生理应答机制的改变。王卫栋等的研究表明，接种根瘤菌激活的紫花苜蓿具有较强的抗氧化和浸透调节能力，接种根瘤菌不激活的紫花苜蓿次之，不接种根瘤菌的紫花苜蓿最弱。抗氧化和浸透调节能力加强，讲明苜蓿耐盐能力提高，也同样讲明接种根瘤菌后构成的共生体耐盐性可能发生变化。本研究中，菌株在根瘤菌耐盐性的离体鉴定中表现最差，但在共生体耐盐性鉴定中其共生体在干重、吸氮量等方面表现较好，讲明在离体培养条件下测定的相关生理指标不能完全与实际应用条件下的相关指标相符，原因可能是根瘤菌需与宿主之间构成较好的匹配性。共生体的构成是一个根瘤菌与植株互作的复杂经过，在此经过中，菌体和植物体双方本身组成、生理特
16、性及生理应答机制发生不同程度变化。因而，在对根瘤菌进行挑选和耐盐性研究时，需关注其在离体培养和生产应用中表现出的生理特性的差异。同时，所选出的高效共生体系在实际生产环境中的效果要通过盐渍地大田试验进一步验证，使根瘤菌能在与豆科绿肥联合固氮和提高植株耐盐能力方面发挥更好的潜力。本研究对青海高原土著箭筈豌豆根瘤菌进行了挑选及耐盐性评价。挑选出株结瘤效果较好的根瘤菌、和。离体培养试验结果，个菌株在不同程度盐胁迫下耐盐性强弱不同，呈三类明显的特征，即和耐盐性最强，和居中，最差。共生体耐盐性鉴定结果与离体培养试验结果不尽一致，表现为接种和在中、低浓度胁迫下促进共生体生长能力较强。总体来看，菌株和具有耐盐性应用前景。