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1、高效石油降解菌群构建（海洋环境科学杂志）2014年第四期1材料与方法11试验菌株与培养基试验采用的6株石油降解菌是从上海市淞沪码头和天津滨海新区受原油污染的船舶港口以及大连近海域的表层海水经柴油挑选、分离而得，分别命名为D3、T4、4、T1、D4和3。试验经过中用磷酸盐缓冲液将其配制成均一浓度的菌液。试验采用的培养基及溶液包括:葡萄糖培养基:葡萄糖，3g;NaCl，5g;酵母提取物，3g;蛋白胨，3g;K2HPO43H2O，27g;蒸馏水，1000mL;pH为72。柴油海盐培养基:海盐，35g;柴油质量浓度为02%;蒸馏水，1000mL;pH为7072。磷酸盐缓冲液:K2HPO4，2175g;
2、Na2HPO4，334g;KH2PO4，87g;NH4Cl，50g;蒸馏水，1000mL。磷酸缓冲液用于洗涤、制备菌悬液。12分析测试项目及方法柴油浓度的测定基于ET1200水中油份浓度分析仪，水样首先经CCl4(环保级)萃取水中油份(萃取采用ET3200B自动萃取仪，萃取2min)，通过测定2930cm1(CH2基团C-H键的伸缩振动)、2960cm1(CH3基团C-H键的伸缩振动)和3030cm1(芳香基环中C-H键的伸缩振动)谱带处的吸光度A2930、A2960、A3030计算而得。降解率(%)=(1-残余柴油浓度/空白柴油浓度)100%细菌细胞疏水率测定方法:本实验采用微生物粘着碳烃化
3、合物法(microbialadhesiontohydro-carbons，MATH)测定细胞外表疏水性。向圆底玻璃试管(酸处理，d=10mm)内参加4mL菌悬液(OD值10)，再参加15mLC8H10作为有机相。用玻璃小塞封口，室温(201)剧烈振荡60s，静置15min分层。用无菌注射针头快速汲取下相水溶液30mL，以磷酸盐缓冲液为空白对照，在600nm波长下测定A值。每个样品重复测定3次。同时作不加有机相的对照组。细菌的细胞外表疏水率(CSH)按下式计算:CSH(%)=(对照组A600nm-实验组A600nm)100%/对照组A600nm微生物生物量采用光电比浊法用UV-4802双光束紫外
4、可见分光光度计以600nm波长处培养液的OD值表示。GC-MS分析:试验仪器采用Agilent5975C，样品用CH2Cl2萃取。试验条件如下:载气:He;流量:08mL/min;色谱柱:DB-5MS30m025mm025m;进样方式:分流(分流比为100:1);进样量:1L;进样口温度:250;传输线温度为280;柱温程序:100(15/min)、170(10/min)、300(3min)。离子化方式:EI;离子化能量:70eV;离子化电流:300A;离子源温度:200;扫描范围:50550amu，自动调谐;质谱检索:利用NIST谱库。13单一菌株的降解性能研究将1mL石油降解菌菌液分别参加
5、50mL柴油浓度分别为01%(800mg/L)、02%(1600mg/L)、03%(2400mg/L)、04%(3200mg/L)、05%(4000mg/L)的柴油海盐培养基中，在25、pH为7，150r/min的条件下培养7d，天天取样测定柴油的降解率及降解量，每组试验3个平行，取平均值，分析菌株的降解能力。14混合菌株的降解性能研究将1mL混合菌液(6种菌株按等比混合的方式)参加至50mL柴油浓度为02%(1600mg/L)的柴油海盐培养基中，在25、pH为7，150r/min的条件下培养7d，测定系统OD600的值，以及柴油降解率，每组试验3个平行，取平均值。15高效菌株之间协同作用分析
6、以T4、4和D3为受试微生物，将1mL同批次的单菌株菌液和混合菌液(采用等比混合的方式)分别参加50mL柴油浓度为02%(1600mg/L)的柴油海盐培养基中，于25、150r/min的振荡培养箱中培养6d，以不加石油菌的柴油培养基中柴油浓度作为空白样，测定柴油浓度，与计算混合菌液的理论降解率和实际降解率，每组试验三个平行，取平均值。混合菌液理论降解率计算方法:二元混合菌理论降解率=(X1+X2)/2三元混合菌理论降解率=(X1+X2+X3)/3X1、X2、X3混合菌中菌株在单菌试验中的降解率。2结果与讨论21单一菌株降解性能研究6种石油降解菌的单一菌株对不同浓度柴油的降解能力，试验结果如图1
7、所示。从图1中能够看出，不同浓度的柴油对微生物的影响不同。T4的降解率受柴油浓度影响较小，且降解率一直保持在83%以上，这讲明T4对柴油浓度具有很好的耐受力;T1和D3受柴油浓度影响波动较大，在浓度为02%时到达降解率的最大值，分别为78%和88%，这是由于柴油浓度偏低导致以柴油为碳源的微生物的生物量偏低进而使得降解率较低，而过高的柴油浓度又会抑制微生物的活性，同样会使降解率降低;3和4随柴油浓度的升高呈现逐步上升的趋势，这是由于试验所采用的柴油浓度并缺乏以对这两种微生物产生抑制，微生物利用柴油不断提高生物量，进而促进了柴油降解率;而D4随着柴油浓度的升高，降解率呈逐步下降的趋势，更适于低浓度
8、污染的修复。柴油的降解量随浓度的升高呈上升趋势，表明6种菌株均能够很好的利用柴油作为本身生长代谢的原料。22混合菌株降解性能研究6种石油降解菌等比混合得到的混合菌液对柴油的降解率以及本身生物量随时间的变化如图2所示。从图2中能够看出，混合菌对柴油的降解率和OD600值均随着时间的增长而升高，二者之间趋势一样存在明显的正相关，MNAL-HADHAMI14，AikateriniPapazi15，TomasLOstberg16等研究均表明生物量的增长是影响石油污染物去除效率的主要因素。培养7d之后，将混合菌的去除效果与不加石油菌的柴油培养基和只添加D3单一菌株的柴油培养基做比照，得到的GC-MS结果
9、如图3所示。从图3中能够看出，比照在该柴油浓度下降解率最高的D3和空白样品，混合菌能够对柴油进一步的降解，尤其是C13C19(出峰时间在20min25min)的组分几乎全部降解，其降解性能优于单一菌株，讲明混合菌的构建能够在菌株之间构成协同机制，促进柴油的降解。23高效菌株之间的协同作用分析以T4、4和D3为受试微生物，考察二元混合菌和三元混合菌对柴油的6d降解率的实际值和理论值，其结果如图4所示。图4混合菌对柴油的6d降解率Fig4Six-daysbiodegradationrateofmixedstrains从图4中能够看出，三元混合菌的实际降解率与理论降解率相比有略微的提高，二元混合菌T
10、4/4和4/D3的实际值比理论值的提升相对明显，分别高出3%和13%，而T4和D3混合时对柴油降解率的实际值则要低于理论值，这可能是由于当4与T4或D3混合时4为优势菌株，T4和D3能够在不同程度上与4发生协同作用，促进4对柴油的降解;而T4和D3混合时，二者之间存在竞争机制或拮抗作用，使得相互对柴油的降解遭到抑制。3结论(1)挑选出的6种石油降解菌中，T4的降解率受柴油浓度影响较小，且一直保持在83%以上;T1和D3在柴油浓度为02%时降解率最高，分别为78%和88%;3和4的降解率随柴油浓度的升高呈现逐步上升的趋势，合适高浓度石油污染的修复，而D4的降解率随着柴油浓度的升高而下降，合适低浓度石油污染的修复。(2)6种石油降解菌按等比混合的方式构建的混合菌其降解率和生物量均随时间的增长而增加，存在正相关关系。混合菌的降解性能优于单一菌株，对于C13C19的组分几乎全部降解。(3)三元混合菌降解率的实际值比理论值略有提高，二元混合菌T4/4、4/D3中存在一定的协同机制使得其实际值比理论值分别高出3%和13%;T4/D3菌株间存在一定拮抗机制，实际值低于理论值。