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1、小米蛋白体外消化率的影响为探究不同热处理方式的小米蛋白质的消化情况，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶体外模拟消化法测定蒸制、煮制、挤压处理并经淀粉酶解的小米蛋白消化率。对从小米生粉中提取的醇溶蛋白蒸制、煮制的蛋白消化率进行测定，结果表明，经120min的胃蛋白酶和胰蛋白酶处理，蒸制、煮制和挤压处理的小米的体外蛋白消化率分别较未处理小米降低了31.00%，17.15%和11.02%。蒸煮的醇溶蛋白消化率也分别降低了35.57%和28.63%。蒸煮对小麦蛋白的消化率有不利影响，挤压处理优于蒸煮处理。蒸煮处理降低小麦蛋白体外消化率可能与醇溶蛋白消化率的降低有关。小米；蒸制；煮制；挤压；蛋白消化率小米从属禾本科
2、草本植物，是世界上主要粮食作物之一，主要种植在亚洲和非洲。我国种植的多为谷子，谷子脱壳后的种仁即小米。小米适口性好，营养丰富，深受我国北方人民的喜欢。小米的蛋白质含量较高，其干基平均含量为13.08%，高于其它禾谷类作物1。其中醇溶蛋白占46%，是小米中含量最多的一种蛋白，此外还有21.1%的碱溶蛋白以及5.5%的清蛋白和球蛋白2。通常用来评价食物蛋白好坏的最主要的2个指标是蛋白质的氨基酸组成和蛋白消化率3。在小米蛋白质的氨基酸组成形式中，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸和天门冬氨酸是小米氨基酸的主要组成部分，赖氨酸和苏氨酸是小米中的第一、第二限制性氨基酸4-5。蛋白消化率是动物从食物中所消化吸收的蛋白
3、质占总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标6。对于食物蛋白质消化率的研究通常采用建立蛋白质体外消化模型模拟食物在胃和小肠中的消化情况的方法，胃蛋白酶-胰蛋白酶体外模拟消化法是一种常见的方法。影响蛋白质消化性的因素可归为两类：外因主要是酚类化合物、植酸、碳水化合物、脂类及蛋白酶抑制剂等，内因主要是指蛋白质本身的构造特性7。蛋白质经加热处理后其构造会发生改变，进而影响其消化率。绝大多数谷物如大米、玉米、荞麦等在一定的加热处理之后的蛋白消化率都会有所提高8-10，但也有个别谷物如高粱，蒸煮之后的蛋白消化率反而降低11。小米作为一种公认的营养保健养胃米，它与高粱在蛋白质组成上非常类似。刘思思1
4、2研究发现，蒸煮之后打浆的小米乳蛋白质具有较低的消化率，而小米醇溶蛋白本身构成的二硫键及强烈的疏水性是导致小米蛋白抗消化的主要原因。本研究主要采用胃蛋白酶-胰蛋白酶体外模拟消化的方法，分析小米和小米醇溶蛋白经蒸制、煮制和挤压处理之后蛋白消化率的变化情况，讨论不同加热处理方式对小米蛋白消化率的影响，为小米蛋白的品质评价以及小米相关产品的开发提供根据。1材料与方法1.1材料谷子：长生07，产自山西。1.2主要试剂胃蛋白酶活性：8002500U/mg，北京拜尔迪生物技术有限公司；胰蛋白酶活性：250Umg，北京拜尔迪生物技术有限公司；-淀粉酶活性6000U/mg，北京博奥拓达科技有限公司。1.3主要
5、设备与仪器三立式捣精机SY88-TH，双龙机械产业；高速万能粉碎机LD-T300A，上海顶帅电器有限公司；双螺杆试验机DS30-，山东赛信机械有限公司；恒温水浴振荡器SHA-BA，金坛市荣华仪器制造有限公司；冷冻枯燥机LGJ-2C，北京市四环科学仪器厂有限公司；高速冷冻离心机GL-20G-，上海安亭科学仪器厂；控温消煮炉KXL-1010，北京市通润源机电技术责任有限公司；电子精细天平，奥豪斯国际贸易上海有限公司；梅特勒-托利多pH计FE20，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；凯氏定氮仪KDY-9820，北京市通润源机电技术责任有限公司。1.4方法1.4.1样品制备谷子样品经捣精机脱壳，分别做下面
6、处理：蒸制：小米与水以15mV混合，上汽后蒸制25min，于烘箱内58烘干8h，磨粉，糊化度为92.67%。煮制：小米与水以120mV混合，水开后煮制30min，于烘箱内58烘干12h后磨粉，糊化度为91.88%。挤压：小米磨粉，水分调制16%，双螺杆挤压设备设定：一区温度90，二区150，三区190，螺杆转速120r/min，喂料速度25r/min，糊化度为92.05%。1.4.2小米醇溶蛋白提取小米脱壳后磨粉，过40目筛，小米粉正己烷=15W/V振荡4h脱脂，静止1h除去上清液，将沉淀在通风橱内风干。风干的小米粉粉碎后过60目筛，用65%乙醇溶液以料液比16，75水浴振荡1h，浸提液800
7、0r/min离心15min。取上清液在4冰箱内进行透析，2h换1次水。换水34次后取透析袋内溶液8000r/min离心15min，将沉淀在-20冰箱内速冻，于冷冻枯燥机内冷冻枯燥12h，获得的蛋白纯度在85%以上。1.4.3淀粉酶处理取5g样品于150mL锥形瓶中，以料液比15mV加水，37水浴5min，以酶与底物比例为1100mm参加淀粉酶，在恒温水浴振荡器上37水浴30min，以确保样品中的淀粉充分水解。1.4.4蛋白质体外消化小米蛋白质的体外消化实验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶体外消化模型。详细操作如下：准确称取一定质量的样品分散于0.1mol/LHCl中构成50g/L的溶液，置于37水浴中预
8、热5min，以酶底物为1100mm参加胃蛋白酶，在37恒温振荡器上反响，分别在不同的消化时间0，30，60，120min取样，用1mol/LNaOH调节pH7.0终止消化反响。对120min时所得消化液调节pH7.0，以酶底物为1100mm参加胰蛋白酶，在消化30，60，90，120min之后煮沸停止反响，分别取样分析13。1.4.5体外消化率测定体外消化率采用TCA-NSI三氯乙酸氮溶指数法14测定和计算。取5mL不同消化液于5mL10%TCA中，4000r/min离心20min，沉淀用10%TCA洗涤2次，离心得到TCA不溶组分。TCA不溶性氮含量采用凯氏定氮法测得，氮含量采用凯氏定氮法G
9、B5009.5-2010测定，消化经过氮释放量由下式计算。2结果分析2.1不同加热处理的小米蛋白消化率经蒸制、煮制和挤压处理的小米样品蛋白消化率变化情况如图1所示。胃蛋白酶和胰蛋白酶各消化120min，未经处理的小米蛋白消化率到达66.38%，而经蒸制、煮制和挤压处理的小米蛋白消化率分别下降了41.65%，32.52%和1.94%。在胃蛋白酶消化经过中，蒸小米、煮小米和挤压小米蛋白消化率的变化率在前30min较大，之后逐步减小，甚至趋于0，而生小米的蛋白消化率的变化率则在前30min较小，之后迅速提高。这可能与包裹小米蛋白体的其它成分如淀粉等有关。这一揣测可以在后面经淀粉酶解后不同加热处理的小
10、米蛋白的消化率的变化中得到印证。在胰蛋白酶消化经过中，除挤压小米外，生小米和蒸煮小米的蛋白消化率的变化率几乎不再变化，而挤压小米的蛋白消化率先增高后趋于0。通常在谷物蛋白体周围都存在淀粉颗粒而影响蛋白的消化。在人体消化食物的经过中，先有一个唾液淀粉酶解的经过。将经各种处理的小米先用淀粉酶解，后用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。由图2可看出，经淀粉酶解的各种处理的小米蛋白消化率显著提高。表1列出最终消化率的比照情况。经淀粉酶解后，生小米、蒸小米、煮小米和挤压小米的蛋白消化率分别提高了29.89%，53.60%，59.48%和17.87%。生小米在经淀粉酶处理后蛋白消化率到达86.22%，比经一样条件蒸煮
11、处理的大米蛋白消化率75.84%和81.09%高。几种加热处理后小米的蛋白消化率变化情况较未加淀粉酶时有一定的差异。从图2可看出，淀粉酶解后蒸小米、煮小米和挤压小米的蛋白消化率较生小米分别降低了31.00%，17.15%和11.02%。在胃蛋白酶解阶段，小米蛋白消化率的变化率在前30min较大，之后减小，甚至趋近于0。在胃蛋白酶终止作用时，蒸小米、煮小米和挤压小米的蛋白消化率非常接近。在胰蛋白酶作用阶段，生小米和蒸小米的蛋白消化率几乎不再变化，挤压小米的蛋白消化率先升高后趋于平缓，煮小米的消化率则呈直线升高。2.2不同加热处理的小米醇溶蛋白的消化率小米蛋白中约有46%为醇溶蛋白3，是含量最多的
12、一种蛋白。其经不同加工处理的消化率的变化对小米总蛋白的消化率有一定影响。因本试验中采用双螺杆挤压膨化机对样品进行挤压膨化，所需物料量较大，故没有研究挤压处理的醇溶蛋白。如图3所示，蒸制和煮制的小米醇溶蛋白的消化率分别为54.21%和48.94%，较生蛋白分别降低了35.57%和28.63%。在胃蛋白酶消化阶段，前30min蒸蛋白的消化率最高，之后趋于平缓，直至胰蛋白酶消化结束。生蛋白和煮蛋白的消化率的变化趋势一样，在胃蛋白酶消化阶段，前60min消化率提高较快，之后减慢，甚至趋于平缓；在胰蛋白酶消化阶段，消化率先提高后趋于平缓。醇溶蛋白的消化率变化规律和小米蛋白消化率变化趋势类似，揣测醇溶蛋白
13、在加热经过中的变化，很可能是影响小米蛋白消化率的一个主要因素。湿热处理对蛋白质的影响较大，对于大多数谷物来讲，适宜的热处理可提高蛋白质的消化率和必需氨基酸的生物有效性15。也有一些谷物在湿热处理下蛋白质的消化率反而降低。本研究发现蒸煮加工对小米蛋白的消化具有不利的影响，这与之前很多研究10、16-18报道的高粱蛋白质消化率因蒸煮而降低的结果类似。这些研究发现醇溶蛋白的低溶解性和二硫键的构成，很可能是造成高粱蒸煮后蛋白消化率降低的主要原因。Hamaker等10通过不同的溶剂对未经蒸煮和蒸煮的高粱醇溶蛋白进行提取，发现蒸煮后用酒精提取的醇溶蛋白成分明显减少，而用乙醇加2-巯基乙醇和亚硫酸钠的溶剂提
14、取的醇溶蛋白明显增加，由此得出蒸煮之后醇溶蛋白的溶解度降低的结论。早在1991年，Shull19等根据分子质量将醇溶蛋白分成3类，即位于蛋白体中心的-醇溶蛋白24ku和26ku以及位于外围的-醇溶蛋白20，18ku和16ku和-醇溶蛋白28ku。Rom17和Oria18等通过电镜观察到消化经过中，经蒸煮的高粱蛋白体的外围很难被酶毁坏，而在添加了能够毁坏二硫键的复原剂后，其外围会出现明显的凹陷，揣测是由于-和-醇溶蛋白通过二硫键构成抵抗酶的聚合物，进而保护内部的-醇溶蛋白不被消化。Hamaker10等通过电泳的方法也发现了类似结果。刘思思12对小米所含4种蛋白进行电泳，发现含量最多的醇溶蛋白主要
15、分布在低分子质量范围，其电泳图谱与高粱基本一样，有-1821ku、-15ku、-23ku醇溶蛋白以及分布在12ku的4条谱带。通常小米蛋白在60左右会发生热变性。在对小米乳经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的残渣电泳后，刘思思12发现醇溶蛋白仅有1821ku的少部分蛋白条带消失，进一步经亚硫酸氢钠处理消化残渣后大部分电泳条带消失，讲明小米醇溶蛋白中的二硫键是影响小米蛋白消化率的一个主要的原因。小米醇溶蛋白，如高粱醇溶蛋白一样，通过二硫键在外围构成致密的保护构造，阻止蛋白酶与蛋白的结合，进而导致消化率低。刘思思12还发现，蒸煮后的小米醇溶蛋白和生的醇溶蛋白的消化残渣用亚硫酸氢钠处理后，其电泳条带无显著差异
16、，讲明亚基间未构成新的二硫键。本研究发现蒸煮后小米蛋白的消化率明显降低。湿热处理后小米蛋白质消化率的降低能否与醇溶蛋白加热后构成二硫键有关，这尚需证明。CalvinOnyango20等人对玉米-小米预混粉烹煮、发酵、挤压等处理后也发现，经发酵、挤压以及发酵后再挤压几种处理后，预混粉的蛋白消化率较生粉明显提高，然而经发酵再烹煮后，预混粉的蛋白消化率甚至较生粉还低，CalvinOnyango揣测这可能是由于长时间加热熟化导致蛋白多聚体的构成，进而抵抗酶的作用而致。挤压作为一种高温短时的加热处理方式，在加工经过中，对谷物蛋白质有很大的影响。挤压温度和样品水分是影响蛋白质构造的重要指标。通过挤压导致的
17、蛋白质变性能够暴露蛋白酶作用位点，进而提高蛋白消化率20，然而也会通过疏水作用、二硫键连同其它形式的共价键共同作用，使蛋白质发生聚集，导致溶解性降低21，进而降低蛋白质消化率。通过选择适宜的挤压温度和样品水分来实现提高小米蛋白消化率的目的。食物的消化是一个复杂的经过，蛋白的消化率受很多因素的影响。本研究发现经蒸制、煮制的小米蛋白的消化率显著低于未经处理的小米蛋白消化率，揣测这可能与小米醇溶蛋白在加热经过中构成致密的共聚体以及疏水性的加强而导致蛋白酶与蛋白质的接触遭到阻碍有关。关于小米蛋白在体外消化经过中的变化情况还需进一步研究。挤压处理的加工方式在影响小米蛋白消化率方面优于蒸制和煮制。挤压处理的最优温度和样品水分含量还需研究。