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1、鹦鹉热衣原体的PCR检测（畜牧与兽医杂志）2014年第九期1材料与方法1.1核酸提取取衣原体、细菌培养液或样本悬液200L，参加裂解液400L，混匀，室温静置23min，先后以酚/氯仿/异戊醇(25241)和氯仿各抽提1次，取上清参加0.8体积20预冷的异丙醇，混匀，412000r/min离心10min，沉淀用75%乙醇洗涤1次后，室温枯燥35min，参加超纯水30L溶解沉淀。裂解液:5mol/L异硫氰酸胍，0.05mol/LTrisHCl(pH6.4)，0.02mol/LEDTA(pH8.0)，1.3%TritonX100，充分溶解后备用。1.2荧光PC荧光PC反响体系:TaqMan荧光PC
2、MasterMix12.5L，上、下游引物(20pmol/L)各0.5L，探针(10pmol/L)0.25L，DNA模板5L，加超纯水至25L。扩增条件:95预变性10min后;9515s、57.51min，40个循环。1.3特异性分别提取CpsCB3以及鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺菌CMCC(B)51105、沙门菌ATCC14028、金色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、霍乱弧菌ATCC51394、副溶血弧菌89001、单增李斯特菌CMCC(B)54002、蜡样芽孢杆菌ATCC63301、甲型溶血型链球菌
3、CMCC32205、阪崎氏肠杆菌ATCC29544等的DNA。用Y1和Y2荧光PC进行扩增，分析方法的特异性。1.4灵敏度将CpsCB3基因组DNA和已知浓度的目的DN断分别做10倍倍比稀释，每个稀释度3个重复，用相应的Y1和Y2荧光PC方法进行扩增，比拟分析扩增的灵敏度。1.5常规PC常规PC反响体系:常规PCMasterMix12.5L，上下游引物(浓度为20mol/L)各0.5L、DNA模板5L，加超纯水至25L。C1的扩增程序:95预变性10min，9430s、5645s、7245s，扩增35个循环后72延伸10min。C2的扩增程序:95预变性10min，9430s，5445s、72
4、45s，扩增35个循环后72延伸10min。X1和X2的扩增程序:95预变性10min，9430s，5340s、721min，扩增35个循环后72延伸10min。1.6临床样品检测从江苏等地的5个养鸽场、2个猪场、2个奶牛场采取了50份鸽泄殖腔拭子、20份猪肺组织、20份牛鼻腔拭子，分别用建立的Y1、Y2荧光PC和C1和C2常规PC进行检测。2结果2.1荧光PC扩增经过对引物和探针浓度、Mg2+和dNTPs浓度、退火温度和时间等进行优化后，用Y1、Y2、Y3荧光PC分别对CpsCB3、分离株1和分离株2进行扩增。发现其中Y1和Y2荧光PC的扩增曲线呈典型的“S型，扩增平台期的荧光值(1.75)
5、明显比Y3荧光PC(0.5)高，对一样浓度的同一模板进行扩增，Y1和Y2荧光PC的Ct值远小于Y3荧光PC，故选择Y1和Y2荧光PC用于下一步的试验。将Y1和Y2荧光PC扩增产物用2.5%琼脂糖电泳，能观察到预期片段大小一致的单一条带，切取目的片断纯化回收后，克隆至pMD18TVector，送大连宝生物公司测序，发现扩增产物序列与预期一致。2.2特异性用Y1和Y2荧光PC对CpsCB3、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体以及大肠杆菌等11种细菌的DNA进行扩增，发现除CpsCB3出现特异性扩增曲线外，其他均没有扩增曲线，讲明这2套荧光PC具有良好的特异性。2.3灵敏度用Y1荧
6、光PC对10倍倍比稀释目的DN断进行扩增，发现其检测下限为7个拷贝，Ct值和DNA稀释倍数的对数的相关性方程为Y=3.52X+42.46，2=0.999;Y2荧光PC对目的DN断的检测下限为2个拷贝，相关性方程为Y=3.34X+40.18，2=0.995(表2)。用Y1和Y2荧光PC对10倍倍比稀释的CpsCB3基因组DNA进行扩增，发现Y1的检测下限为108稀释倍数，相关性方程为Y=3.49X+14.26，2=0.989，变异系数CV(%)为0.09%2.2%(n=3);Y2的检测下限为107稀释倍数，相关性方程为Y=3.59X+13.03，2=0.996，变异系数CV(%)为0.57%1.
7、8%(n=3)，讲明这2套荧光PC具有良好的灵敏度和重复性。2.4常规PC经过反响条件优化后，用C1和C2、X1和X2常规PC分别对CpsCB3、分离株1和分离株2进行扩增，产物用1.5%琼脂糖电泳，能观察到预期片段大小一致的单一条带，扩增产物送大连宝生物公司测序，发现所有扩增产物序列与预期一致。并且这4套PC对鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体、猪肺炎支原体、猪鼻支原体以及大肠杆菌等11种细菌核酸不能扩增到目的条带，讲明建立的方法具有良好的特异性。其中C1和C2常规PC对目的DN段的检测下限依次为900拷贝和10000拷贝，对与2.3同一管CpsCB3基因组DNA溶液的检测下限依次为105和104(
8、表2)。2.5初步应用将CpsCB3、分离株1和分离株2用X1和X2PC扩增后的产物分别测序，结果用DNAStar软件和NCBI网站上的Blast软件进行分析。发现CpsCB3、分离株1和分离株2的16S23SrNA基因序列与鹦鹉热参考株ChlamydiapsittaciMN株同源性均达99%，与其他Cps同源性为95%99%，与其他衣原体(沙眼衣原体、肺炎衣原体和反刍动物衣原体)同源性为73%91%;发现CpsCB3、分离株1和分离株2的MOMP基因序列与国际鹦鹉热衣原体参考株MN株同源性都为77%，CpsCB3、分离株1和分离株2与已公布的CpsCB3株和CpsCB8株基因同源性均达99%
9、。摘取GenBank中已报道的衣原体基因中对应X1和X2目的片段的序列进行同源性分析，发现X1和X2的扩增片段能有效将Cps区分于其他衣原体。用Y1、Y2荧光PC和C1、C2常规PC检测了来源于江苏等地的50份鸽泄殖腔拭子、20份猪肺组织和20份牛鼻腔拭子，结果均为阴性。讲明建立的方法可用于临床样本的检测和分析。3讨论衣原体介于病毒和细菌之间，兼有细菌和病毒两者的基本生物学特性，直径0.21.5m，由始体和网状体两个生长期组成，主要靠空气传播和接触传播8。目前比拟公认的是分为4个种:沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和反刍动物衣原体9。其中鹦鹉热衣原体分为禽源群、猫源群、流产源群和豚鼠源群4
10、个群、8个血清型，即A、B、C、D、E、F、WC和M56，也有学者以为禽源性鹦鹉热衣原体就有6个血清型10。近年来，随着留鸟迁徙，宠物鸟的增加，动物发病和人感染的报道呈逐年上升趋势，因而鹦鹉热衣原体对畜牧业和人类的危害值得警觉。鹦鹉热衣原体全基因组约为1170kb，其中16S23SrNA与外膜主蛋白(MOMP)的基因序列比拟保守。衣原体的16S23SrNA基因高度保守，且种属间差异不大(同源性为90%以上)，假如将其作为检测的目的基因，不易区分不同种的衣原体。鹦鹉热衣原体MOMP与沙眼衣原体、肺炎衣原体MOMP的同源性分别为68%和71%11，MOMP有4个基因可变区(VDs)分别介于5个高度
11、保守的恒定区之间，其中VD1与VD2区具有血清型特异的抗原决定簇，VD4区具有种属特异性的抗原簇，MOMP抗原决定簇对其毒力和致病性研究以及疫苗研制方面具有重要意义12。目前鹦鹉热衣原体检测方法主要有病原分离鉴定、免疫荧光13、间接血凝抑制试验14、补体结合试验15、ELISA16、常规PC17、荧光PC(包括双杂交探针的荧光PC18、SYBGreen荧光PC19和MGB荧光PC20)等。其中病原分离鉴定、免疫荧光、补体结合试验、间接血凝抑制试验等的耗时长、敏感性较低、易受主客观因素影响;SYBGreen荧光PC的特异性和灵敏度低于探针类的荧光PC，MGB荧光PC对探针匹配性的要求极高，而鹦鹉
12、热衣原体内的群和血清型较多，各群各型之间存在一定的基因差异，并且野毒株之间也存在一定的变异，一旦出现某个碱基与MGB探针不匹配，就可能呈现阴性反响，有漏检的可能。本研究建立的2套鹦鹉热衣原体TaqMan荧光PC具有良好的特异性、灵敏度和重复性，对基因组和双链目的DNA的检测下限明显优于常规PC，因而，检测时建议优先选用TaqMan荧光PC。由于鹦鹉热衣原体和沙眼衣原体、肺炎衣原体、反刍动物衣原体之间的基因序列同源性比拟高，衣原体各种之间的序列差异区在鹦鹉热衣原体不同毒株之间也存在一定差异，因而，不易设计鹦鹉热衣原体特异性的引物和探针。本研究经过反复比对，设计的引物和探针与其他衣原体的序列差异为
13、210个碱基。由于鹦鹉热衣原体的宿主种类繁多，很多宿主也能感染其他衣原体，为确保检测的准确性，本研究进一步设计并建立了2套衣原体科的通用PC，其包含可将鹦鹉热衣原体与其他衣原体区分的可变区，一旦荧光PC检测出现阳性结果，可用衣原体通用PC对扩增产物进行测序分析，进一步鉴别确认。笔者以为可先对样本用具有快速、灵敏等特点且基因位点不同的2套荧光PC进行检测，即能对大量样本进行快速初筛，还可避免漏检;而后再用衣原体通用PC进行序列确认，确保结果的准确性，避免误检。总之，本文建立的方法具有较好的应用前景，可为鹦鹉热衣原体的大范围初筛和快速诊断提有效手段，为鹦鹉热衣原体的日常监测、流行病学调查和防控提供可行之策。