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1、人羊水祖细胞的分离（生物工程学报杂志）2014年第六期1材料与方法1.1标本来源20例孕中期(孕1622周)羊水标本来自在上海交通大学医学院附属瑞金医院进行血友病产前诊断检查剩余的废弃羊水标本。所有羊水标本的使用经孕妇知情同意，并经瑞金医院伦理委员会通过。1.2主要试剂羊水细胞完全培养基II和TRIZOL是美国Invitrogen公司的产品；75cm2培养瓶购自美国Corning公司；RT-PCR试剂盒购于罗氏公司；PCR引物自行设计由Invitrogen公司合成，序列见表1。免疫荧光抗体见表2。phFIX质粒由上海医学遗传研究所曾溢滔教授惠赠。1.3方法1.3.1羊水细胞分离和培养将无血液污
2、染的孕中期羊水标本(10mL)400g离心10min,弃上清，参加完全培养基AmniomaxIIcomplete2mL，将细胞悬浮后接种至6孔板中，培养皿经0.2%明胶包被，随后置于95湿度，5CO2，通过培养基本身对贴壁细胞的自然选择来对羊水细胞进行分离选择培养。37的培养箱中培养6d后，初次换微镜下观察，画出呈致密克隆生长的梭形细胞集落的范围，用无菌细胞刮铲轻刮标定范围，刮下细胞用培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度为4104/mL，接种至24孔培养板中，记为第1代(P1)。以后每隔23d用换液1次，当细胞长到60%70融合时进行1:3的消化传代。1.3.2细胞生长曲线绘制取80融合的P3、P
3、5和P10hAFPCs，消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为2104/mL接种于24孔培养板，每孔0.5mL，置培养箱培养，每3d更换培养液。从第2天起每隔24h随机取3孔细胞计数取其平均值作为当天的细胞数，绘制9d的细胞生长曲线，接种24h后计算细胞倍增时间，公式为TD=tlog2/log(Nt/No)(Nt为t时间的细胞数，No为初种细胞数)。1.3.3荧光免疫染色细胞经4多聚甲醛进行固定30min后用参加封闭液阻断细胞30min，随后在4下参加一抗孵育过夜，稀释比方下，TRA-1-60(1:100)，SSEA4(1:100)，用无抗体的PBS孵育作为阴性对照次日用PBS将未结合的抗体洗脱，参
4、加二抗后在37孵育lh(二抗稀释比例:l:100)，用DAPI进行核染10min；防淬灭液封片后在荧光显微镜下观察并拍照。1.3.4RNA抽提根据Invitrogen公司的TRIZOL操作讲明书进行。1mLTRIZOL参加106细胞中，抽提完成后，50L的水溶解RNA样品，测O.D值定量RNA浓度。1.3.5逆转录按ROCHERTkit操作步骤，取2g的RNA作为逆转录摸板在40L反响体系中逆转录cDNA(ComplementaryDNA)。1.3.6载体构建利用GatewayTechnolgy系统构建质粒(图7A)。1.3.7慢病毒包装与转染采用第3代慢病毒系统，pRsv-REV，pMDlg
5、-pRRE，pMD2G，根据Lipofectamine2000的操作步骤转染293T细胞，48h收获含病毒的上清，以0.45m滤器过滤即参加已贴壁的AFPCs，同时参加polybrene至6g/mL，继续培养24h，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。1.3.8流式细胞仪挑选GFP阳性细胞培养细胞达90%密度后，用0.25%的胰酶消化。PBS洗涤细胞2次，再用PBS悬浮细胞，调整细胞浓度51068106/mL。以未转染的hAFPC为阴性对照。1.3.9ELISA检测培养液中hFIX浓度检测样品时均设二复孔测定，以保证检测结果的准确性。以10个健康个体的混合血浆作为标准物稀释后设定横坐标(对数坐标
6、)，OD值为纵坐标(对数坐标)，得到双对数标准曲线，将样品的OD值代入方程式，所得hFIX浓度以正常人的血浆浓度的百分比来表示。1.3.10凝集测定实验(Clottingassay)测定培养上清hFIX活性通过使用人因子IX缺乏的血浆来做凝血分析，采用BECKMAN公司的ACLTOP全自动凝血分析仪测定FIX活性。10个健康人的混合血浆的血液凝固参数作为对照标准，其活性为100。1.4统计学方法采用SPSS13.0软件分析，实验数据用均数标准差(xs)表示，各组均值比拟采用t检验，P0.05为有显著性差异。2结果与分析2.1羊水祖细胞(hAFPCs)的分离和培养孕中期羊水细胞接种于培养皿后，原
7、代羊水细胞包括两种细胞群：贴壁细胞和非贴壁细胞，而hAFPCs属于贴壁细胞群。培养3d后，在倒置相差显微镜下观察，可见呈克隆样生长的梭形贴壁羊水细胞，细胞间排列严密，核大，核仁分裂象可见。6d后，呈克隆样生长的梭形细胞为主的hAFPCs集落构成(图1)(在20例标本皆培养成功)。原代羊水祖细胞排列有一定的方向性，呈旋涡状、网状及辐射状排列生长(图2A)。集落生长的羊水祖细胞原代生长到第8天时，轻轻的拥无菌刮板刮下后传代至24孔板，记为P1，传代细胞在12h内完全贴壁，约7d后细胞融合80%，再次传代(P2)。传代后生长迅速，根据l:3的比例进行传代时，需34d传代一次。刮下的hAFPCs接种培
8、养后，细胞呈均匀分布生长，形态呈梭形。大约7d到达80融合(图2B)，传到第3代时hAFPCs克隆呈现出均一的成纤维样细胞(图2C)。传至第12代，细胞仍呈现均一的成纤维样，生长速度略有下降(图2D)。羊水祖细胞生长曲线(图3)具有下面共同特征：接种后第12天为潜伏适应期，从第3天起进入指数生长期，第7天到达高峰，以后进入平台期。P3代hAFPCs的群体倍增时间为39.05h，P5代为41.04h，P10代为43.18h，羊水来源的祖细胞随着传代次数的增加增殖能力略有下降。2.2羊水祖细胞中NANOG,OCT4,SOX2mRNA的表达用定量RT-PCR的方法检测了机械分离出的3株AFPC(13
9、)表达干细胞特征基因的情况，选取管家基因-actin为内参照，293T细胞为阴性对照，ESCs为阳性对照。发现NANOG，OCT4，SOX2mRNA在羊水祖细胞(AFPC)中都有表达(图4)，与胚胎干细胞相比，分离出的AFPC表达较高水平的NANOG，SOX2mRNA，均高于ES细胞，其中NANOG的表达较高，达2.9倍(P0.05)。OCT4mRNA的表达比ES细胞低，仅有0.15倍的痕迹量(P0.05)。2.3免疫荧光法检测胚胎干细胞特异性蛋白在羊水祖细胞中的表达为进一步鉴定分离出的hAFPC的特性，我们用免疫化学荧光法来检测一系列在胚胎干细胞外表特异性表达的蛋白SSEA4，TRA1-60
10、，结果发现大部分细胞可见SSEA4，TRA1-60在细胞外表呈阳性(图5)。2.4羊水祖细胞体外成脂肪和成骨诱导分化倒置相差显微镜观察可见，经成脂肪细胞诱导后细胞增殖速度下降，细胞形态发生明显变化，由长梭形变为多边形，诱导7d后细胞内出现圆形脂滴，以后脂滴逐步增加增大，诱导21d，大多数细胞内充满了脂滴，经油红O染色证明为脂滴(图6A-B)。经成骨诱导57d，细胞呈片状重叠生长，细胞形态变得扁平，经碱性磷酸酶染色(AP染色)提示细胞内有大量酶颗粒构成，与成骨细胞活性相关的碱性磷酸酶表达阳性(图6CD)。2.5转染质粒后的AFPC人羊水祖细胞转染PLV-hFIX-GFP质粒72小时后，可见较弱的
11、绿色荧光，96d后荧光明显加强，细胞形态没有变化仍维持成纤维样(图7E)，用胰酶消化后进行流式细胞仪检测，发现阳性细胞为54.91%(图7B)，转染效率可达50%以上。通过流逝挑选出GFP阳性的细胞，经含双倍抗生素的培养液悬浮后移入6孔板中继续培养。挑选出的细胞经2代扩增后，再次进行流式细胞仪检测有绿色荧光的细胞比例，绿色荧光阳性的细胞占95%以上(图7D)，并且在24h内贴壁，48h后进入快速增长期。2.6转染后AFPC表达hFIX抗原浓度(hFIX:Ag)和hFIX活性(hFIX:C)为了检测转染后的羊水祖细胞能否合成FIX并向外分泌，我们以每孔1105的AFPC重新种植在24孔板继续培养
12、8d，分别在每2d换液时留取细胞培养上清液约100uL，-20冰箱保存，直到进行检测FIX:C和FIX:Ag。转染后2d，AFPC已合成hFIX蛋白，在上清液中的浓度为20.77%2.77%(图8)，凝血活性16.42%1.78%。FIX的合成在传代后的第4天到达平台期，为50.35%5.42%，%此后第6天和第8天FIX浓度分别为51.10%6.53%，54.23%4.98%。转染后的羊水细胞表达的hFIX蛋白的水平呈现基本稳定趋势，波动幅度较小。我们还发现上清液中的FIX在凝血实验中也表现出凝血活性，并随着浓度的升高而相应增高，最高可达47.54%3.24%(相对于正常人血清中FIX的活性
13、)。3讨论羊水中有来自胎儿皮肤、消化道、呼吸道和泌尿道等组织的脱落细胞，也有来自羊膜及早期胚胎组织的脱落细胞。其中具有干细胞性质的细胞比例尚无统一的研究结论。Prusa等11报道羊水中表达OCT4的细胞约为0.1%0.5%，DeCoppi等分选的CD117阳性细胞占原代细胞的1。这些数据提示羊水中干细胞数目有限，怎样对其进行有效的分离和扩增培养尤为重要。羊水细胞来源及成分复杂，不同来源的细胞贴壁、生长能力不同，因而培养条件在羊水干细胞的分离培养中起重要作用。本研究使用富含包括bFGF等各类生长因子的AmniomaxcompleteII，有利于羊水祖细胞贴壁生长，并通过机械刮下呈克隆生长的梭形细
14、胞，成功地分离得到形态均一的羊水祖细胞，并对其生物学特点进行了研究。本实验分离得到的羊水祖细胞来源于常规孕中期产前诊断时剩余的羊水标本，与ESCs相比，不会毁坏胚胎组织，因而避免了ESCs的伦理问题；与BM-hMSCs相比，AFPC标本获取是在超声引导下行羊膜腔穿刺得到的，创伤较小，而且AFPC在较长时间内维持自我更新和复制的能力，P10代的生长速度较P3代仅略有下降，与Sayago等报道的相一致。同时我们得到的AFPC还能保持稳定的生物学特性：第3代和第10代AFPC形态上没有明显的区别。有人报道，与骨髓和脐血的hMSCs(第4代)中的端粒酶长度相比，第6代人羊水间充质干细胞的端粒酶长度明显
15、长。这一发现也表明了羊水来源的干/祖细胞比成体的hMSCs有较高的增殖能力，可能是由于AFDC是来源于胚胎早期，更接近ESCs。研究表明人类ES细胞中至少有353个靶基因是OCT4、SOX2和NANOG三者共同拥有的，且3个转录因子在这些基因启动子上的结合位点都互相接近。我们在实验中发现AFPC能够在mRNA分子水平同时表达这3个与胚胎干细胞相关的分子。与胚胎干细胞相比，OCT-4的表达量较低，但有趣的是我们分离得到的羊水祖细胞表达的NANOGmRNA和SOX2mRNA的水平比ESCs还高。大量研究表明，OCT4、NANOG这两个同源异型域基因是体内外维持干细胞自我更新和保持未分化状态的关键转
16、录因子。OCT4的表达水平需维持在一定的水平，假如OCT4过表达，将使胚胎干细胞向内胚层细胞分化，而NANOG的高表达可使人类胚胎干细胞不需要滋养层细胞就可维持干性。近期的一项研究发现表达SOX2的胎儿组织将发育为含有表达SOX2的成体干细胞的组织，在胃、食管道、睾丸、子宫颈、肛门和眼睛晶状体等组织特异性成体细胞群体中表达，并能够更新它们的群体，必要时在特定组织中产生完全分化的细胞。这些现象表明SOX2似乎是一种在所有发育阶段：胚胎、胎儿和成体干细胞中表达的重要转录因子。本实验中分离得到的AFPC在mRNA水平同时表达OCT4，NANOG，SOX2这三个关键基因，其中NANOG和SOX2的表达
17、水平较高，因而羊水祖细胞可能是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一种细胞。为了观察羊水祖细胞能否应用于血友病B的基因治疗，我们通过慢病毒载体同时转入目的基因FIX-cDNA和报告基因GFP。本文使用的hFIXcDNA来自肝脏表达文库，同时克隆hFIX基因内含子的部分序列，置于hFIX之前，具有高效表达的优点。hFIX作为人体血浆中重要的凝血因子，正常情况下由肝细胞合成。最初在肝脏中生成的hFIX是一种酶原，经过在第157位和167位门冬氨酸部位的糖基化。N端12个谷氨酸的羧基化，以及在肽链中Arg45-Ala和Ar180-vaJ处精氨酰氨键的断裂，剪除146180位共35个氨基酸的肽链，生成一条
18、由145个氨基酸构成的轻链和另一条由236个氨基酸构成的重链，并通过二硫键连接起来，最终构成具有丝氨酸蛋白酶活性的活化hFlX。慢病毒载体能够把人凝血因子IX(hFIX)稳定转染到羊水祖细胞，并且体外实验发现FIX能够在羊水祖细胞内合成并分泌到上清液中，而该蛋白的表达水平呈现基本稳定趋势，波动幅度较小，上清液中的浓度在第4天能到达平台期。检测到的FIX凝血活性也与其蛋白浓度呈正相关因而，在体外的培养系统中，羊水祖细胞不仅能够合成hFIX，而且能正确剪切及修饰该蛋白，使其具有正常的凝血功能。转染了hFIX的羊水祖细胞在体外能持续合成有凝血功能的hFIX蛋白，同时保持原有的形态和增殖速度，为基因治疗提供了一种新型载体，羊水祖细胞可能成为胚胎干细胞和成体干细胞以外更好的、适宜的细胞来源之一。为血友病B产前治疗的新方法提供了实验基础和理论根据。