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1、土壤养分对双酯型生物碱的影响（湖北农业科学杂志）2014年第十一期1试验方法1.1色谱条件AgilentZorbaxExtend-C18250mm416mm，5m色谱柱，柱温25，检测波长240nm，流动相为A和B两相梯度洗脱A：乙腈；B：40mmol/L乙酸铵缓冲液氨水调pH10.0；洗脱程序：010min，A为28%；1015min，A为28%33%；1545min，A为33%50%；4560min，A为50%，流速为1.0mL/min。进样量为20L。1.2标准曲线的制备准确汲取0.51mg/mL次乌头碱、0.38mg/mL乌头碱、0.45mg/mL中乌头碱各1mL的混合标品溶液分别进样
2、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0L，平行进样3次，记录峰面积。以平均峰面积y，mAu为纵坐标，质量浓度x，g/mL为横坐标，进行线性回归。各物质的回归方程、相关系数和线性范围见表2。1.3总生物碱生物碱含量的测定采用酸性染料比色法。1.4土壤理化性质的测定土壤肥力指标的测定参考（土壤分析技术规范），其中土壤有机质采用油浴加热重铬酸钾氧化容量法；土壤全氮采用凯氏定氮法；速效磷采用碳酸氢钠浸提钼锑抗比色法；土壤速效钾采用原子吸收分光光度法。2结果与分析2.1精细度试验将“1.2.2中的含适宜浓度的生物碱对照品溶液，按“1.2.1中色谱条件连续平行进样5次，记录各次的峰面积，并计算其RSD值
3、。结果显示，中乌头碱、次乌头碱、乌头碱的RSD值分别为0.61%、0.21%、0.74%、。2.2稳定性试验取同一附子生药材供试品溶液，室温放置0、2、4、6、8、10、12、24、36h后，按“1.2.1中色谱条件平行进样3次，记录各次峰面积，计算各自的生物碱含量。结果显示，中乌头碱、次乌头碱、乌头碱在不同时间量的RSD值分别为0.76%、0.84%、0.93%。2.3重复性试验称取附子生药材细粉共5份，每份约2g，按样品制备方法制备供试品溶液，按“1.2.1中色谱条件测平行样3次，记录各次峰面积，计算3种单酯型生物碱的含量，结果显示中乌头碱、次乌头碱、乌头碱质量分数的RSD值分别为0.48
4、%、0.36%、0.45%。2.4加样回收率试验称取附子枯燥细粉末共15份，每份1g，每5份用于一种生物碱的回收率的测定，一共3组。每一组样品分别参加一样对照品溶液适量，按样品制备方法进行供试品溶液的制备和色谱分析。根据测得量和参加量计算其回收率。计算结果表明，中乌头碱、次乌头碱、乌头碱平均加样回收率n=5分别为99.1%、99.4%、99.0%；RSD值分别为1.21%、1.41%、1.17%。2.5不同产地附子中6种生物碱含量的比拟不同产地的附子双酯型生物碱及总碱含量的分析结果见表3。由表3可知，不同栽培区附子的双酯型生物碱以及总碱含量差异明显。其中就总碱含量比拟，006号四川江油种源总碱
5、含量明显高于其他5个栽培区总碱含量，这与附子道地产区质量较高的结论相符合；就双酯型生物碱含量比拟而言，3种双酯型生物碱含量总和从631.66g/g到1156.80g/g，平均931.13g/g，四川布拖、四川北川以及四川江油001、005、006种源明显高于陕西勉县、陕西城固以及云南布拖002、003、0043种种源。这可能与各栽培区的自然环境、土壤条件以及栽种水平等多种因素有关。2.6不同栽培区土壤养分含量的比拟不同栽培区土壤养分的含量见表4。由表4可知，附子不同栽培区土壤理化性质进行分析发现，不同栽培区土壤有机质、全氮、速效磷、速效钾均存在明显差异。其中四川布拖以及四川江油001和006的
6、全氮以及有机质含量明显高于其他4个栽培区；陕西城固、勉县以及云南禄劝3个栽培区土壤养分含量较低，而四川北川、江油、布拖栽培区土壤肥力状况较好，速效磷和速效钾的含量明显高于陕西城固、勉县以及云南禄劝3个栽培区。这一结果与四川地区的附子产品质量高于陕西以及云南地区产品的现象相一致。但是附子生长以及成分积累不仅与土壤条件有关，遗传、环境以及栽种方式等因素都与其有密切关联。2.7土壤养分与附子中双酯型生物碱和总碱的相关性土壤养分与附子中双酯型生物碱和总碱相关性系数见表5。由表5可知，将不同栽培区附子中双酯型生物碱及总量与相应土壤理化性质进行相关性分析，中乌头碱与速效钾有显著相关性，相关系数为0.888
7、；乌头碱与速效磷有极显著相关性，与速效钾有显著相关性；次乌头碱与速效钾有显著相关性，相关系数为0.813；双酯型生物碱总量与速效磷、速效钾有显著相关性，相关系数分别为0.840、0.897。附子生物碱总碱与土壤中的速效磷有显著相关性，且与中乌头碱、次乌头碱及双酯型生物碱总量有显著相关性；双酯型生物碱总量与全氮以及pH无显著相关性。次乌头碱与中乌头碱和乌头碱均有显著相关性。3小结与讨论中药材中的有效成分主要为植物次生代谢产物，生物碱是附子的生理活性物质，同时也是毒性物质。通过比拟分析能够看出，不同栽培区的附子品种间双酯型生物碱以及总碱含量差异明显。四川江油、北川以及布拖3个栽培区附子的生物碱含量
8、明显高于陕西勉县、城固以及云南禄劝3个栽培区。这与6个栽培区土壤养分含量的比拟分析的结论基本一致。因而土壤因子对附子中生物碱的含量有明显影响，但除了土壤条件外，附子中双酯型生物碱含量的高低可能还与有机体的遗传特性、植物生长的外界环境以及栽培方式等因素密切相关。众所周知四川人工栽培附子的历史悠久，四川江油地区附子的种植方式明显较其他栽培区精细，因而建立附子最优化栽培方式，实现附子高产、高品质、高效益的栽培形式是附子研究领域内存在并亟待解决的问题。生物碱为附子的主要活性成分，是影响附子药理作用的主要因素。土壤作为重要的生态因子对附子的质量有较大影响，其理化性质明显影响附子中化学成分的含量。土壤的理
9、化性质是土壤肥力的重要指标，研究其对附子生物碱含量的影响，对于建立附子最优化栽培方式具有重要的意义。附子生长和有效成分积累除了受土壤条件影响外，气象条件可以以直接影响植物的光合作用等生理活动，或通过改变土壤的理化性质来间接影响植物的生长发育和次生代谢物质的积累。由于土壤的固有性质较难改变，但能够通过追施不同比例的有机肥来提高药材的质量以及产量。一般在生产上，常用氮、磷、钾以及有机质等养分含量的多少来衡量土壤肥力的高低。四川江油、四川北川、四川布拖、云南禄劝、陕西勉县、陕西城固6个栽培区土壤中有机质、全氮、速效磷、速效钾含量存明显差异。相关性分析表明不同栽培区附子中生物碱的含量与相应土壤的理化性
10、质有一定的相关性。中乌头碱与速效钾有显著相关性；乌头碱与速效磷有极显著相关性，与速效钾有显著相关性；双酯型生物碱总量与速效磷有显著相关性。附子是植物乌头的侧根，而磷是植物根系生长的必要成分，土壤中磷的丰缺状况以及供给强度直接影响着附子的生长发育、产量以及品质。土壤中速效磷含量低会影响附子根系生长，也会影响附子生物碱的积累。土壤中钾的含量对于附子植株生长具有重要影响，附子中乌头碱和次乌头碱以及双酯型生物碱总量均与速效钾含量有极显著相关性。在材料005和006中双酯型生物碱的含量均较高，其相应土壤中速效磷和速效钾含量亦高，这与相关性分析结果相一致。因而适当追施磷肥和钾肥可有效提高附子中双酯型生物碱的含量。附子生物碱含量与土壤有机质和pH无显著相关性，这就暗示，土壤中适当的有机质以及pH可能有利于附子的生长，也有可能有利于附子产量的提高，但对附子中生物碱的含量没有明显影响。