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1、犬细小病毒单克隆抗体的制备及应用为制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸，将细胞中分离的免疫小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，建立间接方法挑选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，获得株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为。的亚类为型，腹水抗体效价为，穿插试验表明，可与特异性结合，与其他犬常见病毒无穿插反响。用单克隆抗体制备的检测的胶体金免疫层析试纸条特异性良好，为诊断和研究奠定了基础。关键词：犬细小病毒；病毒分离；单克隆抗体；胶体金免疫层析试纸犬细小病毒病是由犬细小病毒所引起的传染性疾病，可通过直接或间接接触传播，以剧烈的呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特点，可引起犬急性心肌炎。犬细小病毒传播性强，发病率
2、和病死率较高，且可感染狐、貉、狼等动物，对养犬业和皮毛动物等经济动物养殖业可造成宏大经济损失。年，美国科学家最先从患肠炎的犬粪便中分离出。年，徐汉坤等初次报道了犬细小病毒病在我国的出现。在分类上属细小病毒科，病毒呈圆形或六边形，无囊膜，直径约。病毒颗粒具有球型的衣壳，衣壳内包含单链线状，在两端各有一个发夹样的回文构造，量占整个病毒粒子重量的。基因主要编码构造蛋白、和非构造蛋白、。和构成病毒的衣壳，其中是主要构造成分和免疫原性蛋白，能够促使机体产生中和抗体。和蛋白对病毒与宿主细胞之间的识别起重要作用，删除或蛋白的突变体均失去了对宿主细胞的感染能力。近年来，非构造蛋白被以为在病毒的致病性和细胞毒方
3、面起主要作用，并在体外可引起肿瘤细胞凋亡。目前国内外对犬细小病毒的诊断主要通过临床症状诊断、血常规检查和试纸快速诊断等，前两者存在着依靠临床经历、特异性低等缺点，难以到达对犬细小病毒病快速诊断的要求；而快速诊断试纸条主要被国外产品所垄断。本研究用细胞分离的制备获得了单克隆抗体，并用单克隆抗体，初步制备了的胶体金层析快速检测试纸条。材料与方法材料实验动物、细胞株及毒株猫肾细胞系细胞，购自中国兽医药品监察所；犬细小病毒病料，河南牧业经济学院动物医院提供；多发性骨髓瘤细胞，河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室保存；小鼠和日本长耳大白兔，购自河南农业大学实验动物中心；含有基因的重组质粒，河南牧业
4、经济学院生物工程学院生物技术实验室构建并保存；犬瘟热病毒、犬冠状病毒和犬腺状病毒，河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室鉴定并保存。主要试剂与药品、提取试剂盒、琼脂糖、和蛋白分子质量标准等，宝生物工程大连有限公司产品；、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、倍储存液，公司产品；胎牛血清，公司产品；羊抗鼠、羊抗兔、羊抗鼠抗体、及氯金酸，公司产品；硝酸纤维素膜膜，公司产品；样品垫和底板，上海金标生物科技有限公司产品；抗体亚类鉴定试剂盒，公司产品；引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；多抗由河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室制备；犬细小病毒阴性血清由河南牧业经济学院动物医院提
5、供；其他常规用试剂为国产或进口分析纯。方法病毒的鉴定样品由河南牧业经济学院动物医院提供。采集出现血便、高热等疑似感染的犬粪便，参加适量磷酸盐缓冲液，离心，收获上清液。按常规提取方法提取，置于保存备用。参照基因序列基因登录号：，设计引物序列为：上游引物：；下游引物：。以提取的样品为模板，使用酶扩增，反响条件为：；，共个循环；最后。取反响产物用琼脂糖凝胶电泳观察结果。病毒的分离和抗原的制备将采集的病料参加含单位青霉素和链霉素的细胞维持液含胎牛血清制成的悬液，混匀后离心，取上清，用微孔滤膜过滤，置保存备用。将单层的细胞用胰蛋白酶消化，按传代，按体积的病料上清同步接种细胞，置、体积分数为的培养箱中培养
6、，设立阴性对照，同时逐日观察细胞病变并进行盲传。待细胞病变到达以上时，反复冻融次，离心，收获上清，参加浓缩，经过凝胶柱层析，收集洗脱峰即为抗原，紫外分光法检测浓度，保存于。间接检测方法的建立以纯化的蛋白作为包被抗原，采用方阵滴定确定阳性血清的最佳浓度和最佳抗原包被浓度，建立了间接方法。通过酶标仪读取值断定结果，以待检血清且为阳性断定标准。另外检测份犬细小病毒阴性血清波长处的值，并将平均值与倍的标准差之和作为阴阳性的临界值，即珚为确定的阴阳性界线。小鼠的免疫将纯化的抗原加等体积弗氏完全佐剂初次免疫周龄小鼠，每隔周分别再注射次以加强免疫。细胞融合前再加强免疫次注射抗原。杂交瘤细胞的挑选和腹水制备按
7、常规方法进行细胞融合，使用建立的间接方法挑选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法进行克隆化培养，选择能够稳定分泌、效价较高的单个克隆进行培养。按常规方法制备腹水，并采用辛酸硫酸铵盐析法和亲和层析法纯化腹水中的。亚型鉴定及染色体计数采用抗体亚类鉴定试剂盒测定制备的的亚类。选择生长良好的杂交瘤细胞，用秋水仙素阻断法进行染色体核型分析，在显微镜下选择染色体分散良好的细胞观察计数。的特异性分析将犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒和犬腺病毒型作为包被抗原进行间接，检测该单克隆抗体的特异性。胶体金抗体的制备将氯金酸溶液，搅拌加热至沸腾，迅速参加柠檬酸三钠溶液，溶液颜色从浅黄逐步变黑，然后变红，继续煮沸，溶液冷却后微
8、孔滤膜过滤，下保存备用。将制备的胶体金，调整至后加纯化后的单抗搅拌，室温静止，经低温高速离心法纯化获得胶体金抗体。免疫试纸条的制备和初步鉴定在玻璃纤维上喷涂胶体金抗体。取蛋白浓度为的多抗标记在硝酸纤维素膜上，设为检测线；取蛋白浓度为的羊抗鼠抗体喷在离检测线处，即为质控线；将喷有检测线和质控线的硝酸纤维素膜与样品垫、胶体金垫、膜、吸水纸组装成试纸条。取和鉴定的犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒和犬腺病毒型，用制备的胶体金试纸条进行检测，验证其特异性。鉴定通过扩增，得到左右的预期大小目的片段，经测序与预期序列一致，证实样品中含有图。病毒的分离从第代开场一般会出现规律性细胞病变，接种病料上清液后约，
9、细胞出现弥散性颗粒，胞浆收缩，细胞变圆；约病变细胞开场逐步拉网、崩解、脱落；约，细胞病变达以上时，收毒，置保存备用图。间接方法建立采用方阵滴定确定抗原的最佳包被浓度和阳性血清最佳稀释度，阳性判定标准为待检血清，且待检血清标准阴性值，当抗原的稀释浓度为，血清的稀释度为，阴性与阳性血清的值相差最大。建立了挑选犬细小病毒的间接方法表。杂交瘤细胞株的挑选经脾细胞与骨髓瘤细胞细胞融合并挑选，获得株能高效分泌抗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为。间接检测，腹水效价为。的亚类鉴定检测抗体的亚类，结果表明，亚类为型。杂交瘤细胞染色体数目小鼠脾细胞的染色体为条，骨髓瘤细胞的染色体为条。统计结果表明，该细胞株染色体
10、数介于条条，大约为小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞染色体数目之和，讲明为两者融合产生图。的特异性检测将分别与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬冠状病毒和犬腺病毒型包被的板进行穿插反响试验，结果发现，与可发生阳性反响，与、和不发生反响，表明制备的与其他犬常见病毒没有穿插反响，制备的单克隆抗体有良好的特异性表。胶体金溶液的制备制成的胶体金溶液日光下肉眼观察透明清亮、颜色为酒红色、无沉淀。经紫外分光光度计检测其最大吸收波长为。胶体金免疫层析试纸的特异性特异性试验结果显示犬瘟热病毒、犬冠状病毒和犬腺病毒型在胶体金免疫层析试纸检测线上均无条带，为阴性。犬细小病毒在检测线上均出现特异性条带，为阳性图。犬细小病毒病传播性强，
11、发病率和病死率较高，且一年四季都有发生，绝大多数年龄、品种的犬类都可被传染，但幼犬和纯种犬更易被感染，病死率也高。细小病毒感染犬类后，一旦发病治愈率十分低，没有特效药，早期确定犬细小病毒病并予以抗病毒、消炎、补液和止呕等治疗，能够提高疗效和存活率，因而，对的早期检测就非常关键。胶体金免疫层析试纸检测方法只需将待测溶液参加试纸条中，静止后一段时间观察结果，不需要仪器设备来读取结果，不需要操作者有专业技能，能减少很大检测工作量和节省大量检测费用，敏感性高，特异性好。但目前我国市场上部分试纸条主要以国外进口为主，价格较为昂贵，市场较为广阔。我们以分离得到并纯化的为抗原，屡次腹腔注射免疫小鼠获得了能够
12、分泌抗的脾细胞，试验结果表明该杂交瘤细胞产生的只与发生特异性反响，与、和无明显的穿插反响，表明制备的单克隆抗体有良好的特异性。另外，经间接检测，腹水效价为。本试验确定了标记的最佳条件，设定为金标抗体、取蛋白浓度为的多抗标记为检测线，蛋白浓度为的兔抗鼠高免血清标记为质控线，初步建立了胶体金免疫层析方法。本试验建立的诊断方法特异性强，与其他种犬常见病毒抗原无穿插反响，具有较好的重复性，与方法结果一致，可用于的快速检测。下一步我们将在反响条件、稳定性及工艺上进一步改良，以期进一步提高检测灵敏度。本研究分离并纯化了，经免疫小鼠后，通过杂交瘤技术获得了株高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞，经鉴定制备出的效价高、特异性强。并在此基础上研发了胶体金免疫层析检测试纸条，快速准确，在临床上具有很好的应用前景，有一定的社会和经济价值，并为犬细小病毒的深化研究奠定了基础。