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1、白血病耐药机制的研究进展摘要急性淋巴细胞性白血病是一种从淋巴细胞起源的恶性克隆性疾病。急性淋巴细胞白血病的治疗包括化疗，造血干细胞移植，免疫治疗，分子靶向治疗等，目前在临床上首先以化疗获得完全缓解后再选择其他治疗，但白血病细胞对化疗药物的耐药成为急性淋巴细胞白血病治疗经过中的主要障碍。目前关于急性淋巴细胞白血病耐药机制的研究非常活跃，本文将从经典耐药机制，如膜转运蛋白、基因改变，以及新的耐药机制，如骨髓微环境的改变、微小NA(MicroNA)等方面作一综述。关键词急性淋巴细胞白血病;耐药机制;MicroNA;MD1;自噬急性淋巴细胞白血病(ALL)是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。ALL
2、的发病率高，且成人ALL治疗缓解率低，复发率及死亡率高。ALL的治疗包括化疗、造血干细胞移植、免疫治疗和分子靶向治疗等。白血病细胞的原发或继发耐药是导致成人ALL疗效差及复发率与死亡率高的重要原因。原发性耐药:原来存在于体内的耐药细胞亚群，随着敏感细胞被选择性杀死而逐步聚集、增殖，并最终成为主要细胞群;继发性耐药:由于化疗药物诱导使细胞特性发生改变，导致耐药性的产生。近年来，人们对ALL耐药机制、怎样克制及逆转耐药进行了较为深化的研究。本文将从膜转运蛋白、基因改变、细胞自我保护机制、化疗药物作用靶点的改变与骨髓微环境改变等方面对ALL的耐药机制作一综述。一、膜转运蛋白与ALL耐药化疗药物需通过
3、细胞膜或者核膜进入胞质或者进入胞核内才能发挥细胞毒作用，而耐药细胞通过异常表达一些膜转运蛋白将化疗药物泵出细胞或改变其在细胞内的分布进而导致耐药的产生。下面为几种经典耐药相关膜转运蛋白。P糖蛋白(P-gp)P糖蛋白是由ABCB1即MD-1基因编码的ATP依靠的有机泵，底物与该有机泵结合，使得P-gp的构象发生改变，将底物转运到细胞外，随后P-gp结合ATP恢复其构象，进而循环泵出药物。部分白血病患者在接受化疗药物后，白血病细胞的P-gp表达会逐步上调，过表达的P-gp能将细胞内药物转运出胞外，进而促使细胞内化疗药物的减少，最终导致白血病耐药。耐阿糖鸟苷(AraG，核苷类似物)的急性T淋巴细胞白
4、血病细胞株MOLT-4中ABCB1基因及P-gp表达上调，抑制该细胞中P-gp的表达使该细胞对AraG敏感性增加1。LinJ等2发现SUP-B15(Ph阳性的急性淋巴细胞白血病细胞株)与其耐药细胞株SUP-B15/I相比，后者的MD1基因及P-gp表达量升高，在耐药细胞株中参加P-gp抑制剂维拉帕米后，该细胞株接受伊马替尼、柔红霉素、长春新碱、VP-16等处理的IC50量较未参加P-gp抑制剂的IC50降低(15.550.51vs22.371.16、51.295.68vs164.3012.59、11.660.79vs16.891.90、265.3329.92vs352.6735.57，P0.0
5、5)。最近ahgozar等3通过对27例幼儿ALL患者骨髓单个核细胞中多药耐药基因的mNA的表达的研究发现:MD1基因的高表达与儿童ALL治疗一年后微小残留病灶阳性的危险度呈正相关。新近研究发现，MD1基因多态性与儿童高危ALL密切相关。Wanida等报道MD1的26号外显子的C3435T及12号外显子的C1236T与高危组儿童ALL显著相关(O=2.6，95%CI=1.1645.808;P=0.028和O=2.231，95%CI=1.0684.659;P=0.047)，提示其可能是高危ALL的分子标志4。多药耐药蛋白(MP)1992年初次在肺癌细胞系中发现MP1。该蛋白含有细胞内表位，与细胞
6、内药物重分布及隔离相关，其结合有机阴离子的特征同样见于其他MP(MP2，MP3，MP4，MP5，MP6)。MP2，MP3，MP5与急性淋巴细胞白血病药物泵出相关。Ansari等5研究发现，MP3AT等位基因A-189与ALL无病生存期的缩短明显相关(P=0.01)。ahgozar等3在2014年报道的一项临床研究发现，幼儿ALL患者骨髓单个核细胞中MP1基因的表达增高与儿童ALL治疗后微小残留病灶阳性的危险率呈正相关。乳腺癌耐药相关蛋白(BCP)BCP是一种ATP结合膜转运蛋白，与米托蒽醌、拓扑替康等耐药相关。Su等6人取T细胞性急性淋巴细胞白血病细胞株PMI8402用伊立替康诱导耐药，得到其
7、多药耐药细胞株CPT-K5，结果发现CPT-K5中BCP的水平显著增高，而该细胞内米托蒽醌水平显著低于PMI8402细胞。Huang等7研究表明，PI3K-AKT-mTO1信号通路的激活能够上调ALL中BCP的表达，进而加强ALL耐药。江雪杰等8亦发现，BCP与成人急淋耐药密切相关(P005)。除上述P-gp，MPs，BCP外，还有一些与耐药相关的膜转运蛋白，但这些蛋白在急性淋巴细胞白血病耐药中的作用目前报道仍较少，如TAP，AA，Sp-gp(P-gp的姐妹蛋白)，其作用有待进一步的研究探索。二、基因表达异常与ALL耐药基因是生物体遗传物质的携带者，一些特定基因的改变与肿瘤细胞耐药的发生密切相
8、关。凋亡相关基因PTENHales等9发现PTEN的缺失引起PI3K-AKT-mTO1信号通路的缓慢激活，导致急性T淋巴细胞白血病细胞对分泌酶抑制剂(GSI)耐药，以及抑制p53PTEN通路介导的细胞凋亡。T急淋细胞中的Notch1基因的活化突变能够导致PTEN的转录后失活，这也是TALL耐药及难治复发的机制之一。BCL-2Shah等10发现BCL-2及MCL-1信号通路改变与急性淋巴细胞白血病的激素耐药相关。Sil-veira等11的研究表明，PI3K抑制剂AS605240与T-ALL激素耐药明显相关，在体内及体外，AS605240与激素均有很强的协同作用，进而增加其对T-ALL细胞的杀伤。
9、Sheila等12发现，BCL2家族成员之一BIM与激素耐药相关，敲除BIM之后，能够恢复ALL细胞对激素的敏感性。BTKBTK(BrutonTyrosineKinase)是一种非受体酪氨酸激酶，在BC信号通路中起重要作用，与B淋巴细胞的增殖，分化，成熟等密切相关。BTK通过与Fas激酶的互相作用，抑制Fas诱导的B淋巴细胞白血病细胞和淋巴瘤细胞的凋亡13。BTK阴性的淋巴瘤细胞系DT-40及AMOS-1对Fas信号诱导的细胞凋亡非常敏感，但导入BTK基因后，此类细胞对Fas信号诱导的细胞凋亡的敏感性明显下降14，然而Fas信号通路则不能诱导BTK阳性的人B淋巴细胞白血病细胞NALM-6的细胞
10、凋亡，提示BTK与细胞耐药呈正相关。新近研究提示，BTK与急性白血病的耐药及不良预后明显相关1516。NF-KBNF-KB为一种重要的核转录因子，其广泛介入多种细胞增殖、分化、凋亡等。Chien等17研究提示，NF-KB与B-ALL的天冬酰胺酶耐药密切相关。目前NF-KB抑制剂Bortezomib已用于多种B细胞肿瘤的临床治疗。FOXM1FOXM1是一种转录因子蛋白质，与细胞周期调节相关。该因子表达异常可导致细胞增殖失控，进而导致肿瘤的发生。该基因与ALL耐药相关，是提示ALL预后差的一个重要指标，亦可能成为ALL新的治疗靶点18。非编码NAMicroNAMicroNA是一类长度约为21nt的
11、非编码NA分子，对真核细胞基因表达、细胞增殖分化及个体发育等方面起调控作用。Zhou等19在其研究中发现:临床上治疗失败患者与治疗后长期无病生存患者相比，前者mi-125b显著增高;mi-125b在耐柔红霉素的急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞中过表达;mi-125b通过直接诱导G蛋白耦合受体激酶2及降低p53表达，进而导致ALL细胞株对柔红霉素的耐药。deOliveira等20发现，与强的松的耐药相关的MicroNA有:mi-18a，mi-193a，mi-218等;与长春新碱的耐药相关的MicroNA有:mi-9，mi-99a，mi-100等;与左旋门冬酰胺酶的耐药相关的MicroN
12、A有:mi-454;与柔红霉素的耐药相关的MicroNA有:mi-99a，mi-100，mi-125b等，而mi-7，mi-216与儿童ALL不良预后密切相关。Liao等21在其研究中发现，mi-181a与ALL耐药细胞系CEM-C1(CCFCEM多药耐药细胞株)多药耐药相关，敲除mi-181a可恢复CEM-C1对喜树碱的敏感性。Nishioka等22研究提示，mi-217与PH阳性ALL的耐酪氨酸激酶抑制剂耐药相关。LncNALncNA是一类长度大于200nt的非编码NA，其介入调节基因转录、翻译等多个经过，在基因调控网络中扮演重要作用。Fernando等23在其研究中发现，高表达的BAL-
13、2与B-ALL泼尼松的耐药相关，敲除BAL-2可提高B-ALL对激素的敏感性。三、骨髓微环境与ALL耐药骨髓微环境由骨髓基质细胞、细胞因子等组成，是造血干细胞生存的场所，与造血干细胞之间存在着复杂的通信网络，调控着干细胞的增殖、分化等。整合素alpha4白血病细胞与骨髓基质细胞之间的互相作用能够导致耐药的产生，即细胞粘附介导的耐药。整合素alpha4为调节白血病细胞归巢及激活滞留功能的重要分子。前期研究证明干扰整合素alpha4介导的急性淋巴细胞白血病的粘附能够提高它们对化疗药物的敏感性，促进微小残留病灶处白血病细胞的去除。Andreeff等24近期研究发现，打断alpha4介导的NF-KB信
14、号通路将阻断白血病细胞赖以生存的信号的传导，导致白血病细胞凋亡。脂肪组织的影响肥胖可导致白血病细胞耐药的产生，进而增加白血病患者的死亡率。肥胖导致白血病细胞耐药的机制:脂肪细胞提供细胞的燃料即能量来源，为白血病细胞增殖、迁移等活动提供更多的能量储备;脂肪细胞及组织影响白血病化疗药物的药代动力学;脂肪细胞及组织直接抑制白血病细胞的凋亡25。Samuel等26发现从T细胞ALL病人身上提取的细胞移植入免疫缺陷鼠体内，经化疗药物作用后，耐药的细胞出现脂肪及胆固醇代谢异常，在体外联合地塞米松与胆固醇通路抑制剂(辛伐他汀)对耐药细胞的杀伤有显著的协同作用。四、细胞自我保护机制的激活与ALL耐药细胞在遭到
15、刺激时会产生应激反响，在该应激反响经过中产生的瀑布式级联效应，引起细胞内环境及细胞功能的变化，进而使得细胞以最好的状态适应该刺激。该应激反响是细胞针对外界环境变化时的自我保护机制。下述一些自我保护机制与耐药发生有关。自噬近年来，自噬在耐药中的作用成为研究热门，自噬是一个吞噬本身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，后与溶酶体融合成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的经过，此为细胞代谢需要和细胞器更新的经过。研究表明，LC3(微管相关蛋白1轻链3)为自噬的标志物，自噬构成时，LC3(即胞浆型LC3)酶解掉小段多肽，转变为LC3(即膜型自噬体LC3)，LC3/LC3比值大小能够用来评估自噬水平的高低
16、。然而，该经过亦能够将药物包裹进自噬体，通过降解或者转运出细胞使细胞内药物浓度下降，进而使细胞逃避被药物杀伤的命运。Yen等27在其研究中用无细胞毒性的ANE(槟榔提取物，一种能够诱导自噬活性的物质)及其30100K的成分ANE30100k诱导人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat，结果显示:ANE及ANE30100k可提高LC3及Atg4B表达水平，诱导自噬的发生，同时使Jurkat细胞对顺铂及5-FU耐药，而自噬抑制剂3甲基腺嘌呤及氯喹则可逆转ANE或ANE30100k诱导的耐药。细胞解毒系统的激活CYP3A5(细胞色素P4503A亚家族多肽5)王婷等28发现，该基因的上调，导致白血病细胞耐
17、药，可能的机制为:细胞色素P450在内质网和线粒体内膜上原位代谢降解多种化疗药物。GSH(谷胱甘肽)GSH与白血病耐药相关，可能的机制:一些化疗药物通过氧化作用导致白血病细胞凋亡，而GSH则可阻断这类化疗药物的氧化作用，进而使白血病细胞的凋亡减少，导致耐药的发生。谷胱甘肽合成酶抑制剂通过抑制谷胱甘肽的合成，加强三氧化二砷诱导细胞凋亡的作用。X-BP1(X-boxbindingprotein1)当细胞遭到刺激后，内质网会产生非折叠蛋白，非折叠蛋白促进X-BP1的表达及激活，X-BP1的激活导致细胞耐受外界环境对它的刺激。Kharabi等29的ECOGE2993临床研究结果表明，在Ph阳性的成人急
18、性淋巴细胞白血病中，XBP1表达较高组病人的长期生存率明显低于XBP1表达较低组。另外，ECOGP9906临床研究结果显示，高XBP1mNA是一个独立的临床不良预后的指标，而XBP1的小分子抑制剂能够选择性诱导白血病患者原代细胞中前体B细胞的凋亡。动物模型研究结果亦证明，XBP1抑制剂显著延长ALL小鼠的生存时间。这为耐药白血病的靶向治疗提供新的思路。五、化疗药物作用靶点的改变与ALL耐药分子靶向药物在ALL治疗中发挥了重要作用，但与经典化疗药物类似，临床上同样会出现分子靶向药物的耐药现象，药物靶基因的改变是白血病细胞对靶向药物产生耐药的主要原因。FLT3Cools等30在其研究中发现FLT3
19、四个不同位点(Ala-627，Asn-676，Phe-691，Gly-697)的突变，导致细胞对FLT3抑制剂(包括PKC412，SU5614，K-252a)产生不同程度的耐药性，但是上述前三个位点突变(Ala-627，Asn-676，Phe-691)的白血病细胞对加大剂量的FLT3抑制剂可恢复敏感，而大剂量抑制剂并不能改变FLT3G697突变带来的耐药，且该位点的突变使得细胞对FLT3抑制剂(包括PKC412，SU5614，K-252a)及其余6种试验中所用的抑制剂均耐药。BC-ABLBC-ABL为慢性髓细胞白血病特征性融合基因。伊马替尼是作用于BC-ABL的靶向药物，已成功应用于慢性髓系白
20、血病的治疗，亦可用于BC-ABL阳性的急性淋巴细胞白血病的治疗。夏君燕等31通过对210例伊马替尼耐药的慢性髓细胞白血病和Ph阳性急性淋巴细胞白血病ABL基因突变的分析，得出ABL的突变率为342%。突变类型及突变率分别为:T315I12%，Y253H11%，G250E7%，E255K7%，M351T6%，E459K5%，Q252H、D276G、F317L、E355G、F359V、H396均为4%。除了有上述基因突变，还检测出插入缺失突变。一个细胞中亦可同时出现几种上述ABL突变。该研究提示BC-ABL突变与慢性髓细胞白血病及Ph阳性急性淋巴细胞白血病耐伊马替尼密切相关。其它除了上述研究较多的
21、ALL耐药机制外，其它一些机制亦与ALL耐药有关。钙结合蛋白S100A6Tamai等32发现，MLLAFF1阳性的急性淋巴细胞白血病通过上调钙结合蛋白S100A6的表达、干扰p53caspase8caspase3通路来躲避肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡。DNA甲基化及组蛋白去乙酰基化DNA甲基化及组蛋白去乙酰基化是导致白血病细胞的耐药原因之一。Burke等33开展了在难治或复发急性淋巴细胞白血病患者中联合地西他滨(去甲基化药物)及伏力诺他(组蛋白去乙酰基酶抑制剂)加化疗药物的耐受性及成效的实验。结果显示，两药联合化疗药物提高了病人缓解率，有效证实了上述观点。TBL1X1(核受体共抑制因子)Jone
22、s等34发现，敲除B-ALL细胞的TBL1X1基因，导致激素反响基因所招募的激素受体减少，进而引起激素通路信号减弱，最终导致白血病细胞对激素治疗产生耐药。去泛素化酶USP9X新近研究发现，去泛素化酶与ALL耐药相关，最近Zhou等35发现，敲除去泛素化酶USP9X，可使激素耐药ALL重新恢复对泼尼松的敏感性，进而提高耐药ALL细胞凋亡。六、结语目前，关于急性淋巴细胞白血病耐药机制的研究已逐步深化，怎样克制及逆转急性淋巴细胞白血病耐药是提高ALL缓解率及治愈率的重要举措。除通过克制经典耐药机制逆转急性淋巴细胞白血病耐药外，新近发现的一些耐药机制，如:自噬、NF-KB信号通路、MicroNA等在急性淋巴细胞白血病耐药中的作用，成为基础及临床研究者的关注热门。但现阶段怎样有效利用上述方法高效逆转ALL病人的临床耐药，以提高ALL的完全缓解率，长期生存率及治愈率，还有待多中心大量病例的临床研究证明。