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1、急性白血病细胞增殖的影响p90核糖体S6激酶p90ribosomalS6kinase，RSK属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是丝裂原活化蛋白激酶mitogen-activatedproteinkinase，MAPK/细胞外信号调节激酶extracellular-signalregulatedkinase，ERK信号通路下游重要的调控因子。在哺乳动物中，RSK家族有RSK1、RSK2、RSK3和RSK4这4个亚型，约73%80%的氨基酸序列一样。RSK蛋白构造最显著的特性是具有2个功能区域，即C末端激酶活性区C-terminalkinasedomain，CTKD及N末端激酶活性区N-terminalki
2、nasedomain，NTKD。RSK13亚型的CTKD主要是接受上游的ERK信号，通过一系列丝氨酸部位的磷酸化及本身磷酸化而快速有效地激活NTKD，进而对RSK底物进行磷酸化，在调节细胞核信号、细胞周期、细胞增殖和蛋白合成等方面发挥重要作用。尽管在人类肿瘤中未发现RSK基因突变，但目前以为RSK1和RSK2为致癌基因，在恶性肿瘤的发生和发展中起促进作用2-5。RSK特异性抑制剂BI-D1870可通过和ATP竞争性结合NTKD区域，特异性抑制RSK活性而不影响其他天冬氨酸谷氨酸转运蛋白激酶如：AMP活化蛋白激酶AMP-activatedproteinkinase，AMPK、MAPK及死亡相关蛋
3、白激酶death-associatedproteinkinase，DAPK等的活性6。BI-D1870可抑制多种类型实体肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡6-8。关于BI-D1870对急性白血病acuteleukemia，AL细胞的作用及其机制尚未明确，本研究主要讨论BI-D1870联合依托泊苷对人类AL细胞的细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期分布的影响。1材料与方法1.1主要试剂RPMI1640培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，淋巴细胞分离液购自美国Mediatech公司，DMSO购自美国Sigma公司，总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自
4、日本TaKaRa公司，实时荧光定量PCR引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，RSK抑制剂BI-D1870购自美国Selleck公司，化疗药物依托泊苷注射液购自江苏恒瑞医药股份有限公司，CCK-8购自日本Dojindo公司，Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒、荧光染料碘化丙啶propidiumiodide，PI和细胞周期检测试剂盒均购自美国BD公司。1.2细胞及细胞培养急性T淋巴细胞白血病细胞Molt-4和Jurkat、急性B淋巴细胞白血病acuteB-lymphoblasticleukemia，B-ALL细胞Nalm-6、急性单核细胞白血病acutemonocyticleukemi
5、a，AML细胞THP1和U937以及急性早幼粒白血病细胞NB-4这6种人类AL细胞均由同济大学附属同济医院药物临床试验研究机构所属实验室传代培养。这6种细胞均用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。1.3实时荧光定量PCR法检测AL细胞中RSK1和RSK2mRNA的表达水平收集上述6种AL细胞及用淋巴细胞分离液分离的健康志愿者外周血单核细胞，根据总RNA提取试剂盒操作讲明书提供的方法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定D260nm/D280nm的值，鉴定RNA的纯度和浓量。应用反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂
6、盒将1g总RNA反转录合成cDNA，以此cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，检测细胞中RSK1和RSK2mRNA的表达水平。RSK1上游引物序列为5-ATT-GGTGTGGGCTCCTACTC-3，下游引物序列为5-CATACAGGATGTTGCTGGGC-3；RSK2上游引物序列为5-ATCAAGCCACCGT-TCAAACC-3，下游引物序列为5-ACTCGGT-GTCTGTGGCTTTA-3；内参照-actin上游引物序列为5-CTGGATTCTGGCGATGGT-GTA-3，下游引物序列为5-CGGACAATT-TCACGTTCAGCA-3。PCR反响条件：95预变性30s；955s
7、、6034s、72延伸40s，共40个循环。以2Ct法计算RSK1和RSK2mRNA的表达水平，Ct目的基因Ct值内参照基因Ct值。1.4CCK-8法检测BI-D1870和依托泊苷对AL细胞增殖的影响1.4.1BI-D1870对Molt-4、Jurkat、Nalm-6、THP1、U937和NB-4细胞增殖的影响取对数生长期的Molt-4、Jurkat、Nalm-6、THP1、U937和NB-4细胞接种于96孔板中1105个/mL，100L/孔，并给予10.0mol/L6BI-D1870处理BI-D1870用DMSO配制，作为实验组，同时设置对照组细胞用含与BI-D1870处理组一样浓度的DMS
8、O进行处理和空白组不含细胞的培养液，每组设3个复孔。当BI-D1870处理细胞0、6、12、24和48h时，参加CCK-810L/孔，37反响2h，上酶联免疫检测仪测定波长为450nm处各孔的吸光度D值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率%1实验组D值空白组D值/对照组D值空白组D值100%。1.4.2不同浓度BI-D1870及依托泊苷单药对Molt-4细胞增殖的影响按1.4.1节的方法接种Molt-4细胞，分别给予0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0mol/L的BI-D1870及0.125、0.25、0.5、1.0、2.0g/mL的依托泊苷单药处理，对照组和空白组的设置与1.4.
9、1节的方法一样，每组设3个复孔。BI-D1870和依托泊苷单药处理细胞24h后，参加CCK-810L/孔，37反响2h，上酶联免疫检测仪测定波长为450nm处各孔的吸光度D值。按1.4.1节的方法计算细胞增殖抑制率，应用Excel软件计算BI-D1870和依托泊苷作用Molt-4细胞24h的半数抑制浓度halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50值。1.4.3BI-D1870联合依托泊苷对Molt-4细胞增殖的影响按1.4.1节的方法接种Molt-4细胞，分别给予40%和60%IC50值的BI-D1870即3.0mol/L和4.0mol/L和依托泊苷即0.2g
10、/mL和0.3g/mL单药及BI-D1870联合依托泊苷处理Molt-4细胞，对照组的设置与1.4.1节的方法一样，每组设3个复孔。BI-D1870和依托泊苷单药及BI-D1870联合依托泊苷处理细胞24h后，参加CCK-810L/孔，37反响2h，上酶联免疫检测仪测定450nm波长处各孔的吸光度D值。按1.4.1节的方法计算细胞增殖抑制率，并应用金正均氏公式QEab/EaEbEaEb，Ea为BI-D1870单药干涉后的细胞增殖抑制率，Eb为依托泊苷单药干涉后的细胞增殖抑制率，Eab为联合用药干涉后的细胞增殖抑制率断定2种药物间的互相作用。当Q0.85时，2药联合具有拮抗作用；当0.85Q1.
11、15时，2药联合为单纯相加作用；当Q1.15时，2药联合具有协同作用。1.5FCM法检测BI-D1870和依托泊苷对Molt-4细胞凋亡及细胞周期分布的影响1.5.1BI-D1870对Molt-4细胞凋亡的影响取对数生长期的Molt-4细胞接种于6孔板中1.5106个/孔，给予7.0mol/L的BI-D1870BI-D1870的IC50值为7.0mol/L处理，对照组的设置与1.4.1节的方法一样。BI-D1870处理Molt-4细胞24h后，应用Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。收集待检测的各组细胞，调整细胞密度为1106个/mL，PBS洗涤后，参加100L1Bindi
12、ngBuffer、5LAnnexin-FITC和5LPI，室温避光反响15min；参加400L1BindingBuffer，4避光反响15min，于1h内上流式细胞仪检测细胞的凋亡率。1.5.2BI-D1870对Molt-4细胞周期分布的影响取对数生长期的Molt-4细胞接种于直径为10cm的培养皿中密度为5106个/皿，给予7.0mol/L的BI-D1870处理，对照组的设置与1.4.1节的方法一样。收集BI-D1870作用24h后的Molt-4细胞，应用细胞周期检测试剂盒检测Molt-4细胞的细胞周期分布情况。在收集的细胞中参加6mL75%的乙醇溶液，4固定过夜；PBS洗涤细胞，将细胞重悬
13、于0.5mLPI染色液中，室温避光反响15min，于1h内上流式细胞仪上流式细胞仪分析前，样品置于4避光保存分析细胞周期的分布情况。1.5.3BI-D1870联合依托泊苷对Molt-4细胞凋亡的影响取对数生长期的Molt-4细胞接种于6孔板中1.5106个/孔，分别给予4.0mol/L的BI-D1870和0.3g/mL的依托泊苷单药及4.0mol/L的BI-D1870联合0.3g/mL的依托泊苷处理，对照组的设置与1.4.1节的方法一样。收集药物处理24h后的各组细胞，按1.5.1节的方法检测各组细胞的细胞凋亡情况。1.6统计学方法本研究中的各项实验均重复3次。应用SPSS13.0软件对实验的
14、结果数据进行统计分析。计量资料以s表示，两独立样本间的比拟采用t检验；多组间均数的比拟采用方差分析，组间两两比拟采用SNK法。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1多种AL细胞中RSK1和RSK2mRNA的表达水平上调应用实时荧光定量PCR法检测了6种AL细胞及健康志愿者外周血单核细胞中RSK1和RSK2mRNA的表达水平。结果图1显示，除Nalm-6细胞以外，Molt-4和THP1细胞中RSK1mRNA的表达水平以及Molt-4、Jurkat、THP1、U937和NB-4细胞中RSK2mRNA的表达水平均高于健康志愿者外周血单核细胞P值均0.05。2.2RSK抑制剂BI-D1870和依
15、托泊苷抑制AL细胞的增殖2.2.1BI-D1870可显著抑制AL细胞的增殖应用CCK-8法检测10.0mol/L的BI-D1870处理Molt-4、Jurkat、Nalm-6、THP1、U937和NB-4细胞0、6、12、24和48h后细胞的增殖情况。结果图2A显示，随着BI-D1870作用时间的延长，6种细胞的增殖抑制率逐步递增P0.05，以Nalm-6和Molt-4细胞较为显著。2.2.2BI-D1870与依托泊苷可协同抑制Molt-4细胞的增殖分别给予Molt-4细胞0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0mol/L的BI-D1870及0.125、0.25、0.5、1.0、2.0
16、g/mL的依托泊苷单药处理24h后，应用CCK-8法检测细胞的增殖情况并计算BI-D1870和依托泊苷作用Molt-4细胞24h的IC50值。结果图2B和2C显示，BI-D1870和依托泊苷作用于Molt-4细胞24h的IC50值分别为7mol/L和0.5g/mL。分别给予40%和60%IC50值的BI-D1870即3.0mol/L和4.0mol/L和依托泊苷即0.2g/mL和0.3g/mL单药及BI-D1870联合依托泊苷处理Molt-4细胞24h后，应用CCK-8法检测细胞的增殖情况，并计算2药联合的Q值。结果图2D和2E显示，2药联合组细胞的增殖抑制率高于各单药组P值均0.01。3.0m
17、ol/L的BI-D1870联合0.2g/mL的依托泊苷作用时，Q1.19；4.0mol/L的BI-D1870联合0.3g/mL的依托泊苷作用时，Q1.20。因而，BI-D1870联合依托泊苷可协同抑制Molt-4细胞的增殖。2.3BI-D1870和依托泊苷促进AL细胞的凋亡并阻滞细胞周期进程2.3.1BI-D1870可诱导Molt-4细胞凋亡并阻滞细胞周期于G2/M期FCM法检测7.0mol/L的BI-D1870处理Molt-4细胞24h后细胞的凋亡和周期分布情况。结果图3A和3B显示，BI-D1870处理组Molt-4细胞的凋亡率明显高于对照组P0.01；BI-D1870处理组G2/M期细胞
18、所占百分比明显高于对照组P0.05。2.3.2BI-D1870可加强依托泊苷诱导的Molt-4细胞凋亡FCM法检测4.0mol/L的BI-D1870和0.3g/mL的依托泊苷单药及4.0mol/L的BI-D1870联合0.3g/mL的依托泊苷处理24h后Molt-4细胞的凋亡情况。结果图3C显示，BI-D1870和依托泊苷单药处理组Molt-4细胞的凋亡率均明显高于对照组P值均0.05，并且BI-D1870联合依托泊苷处理组Molt-4细胞的凋亡率明显高于各单药组P值均0.01。这一结果讲明，BI-D1870可促进依托泊苷诱导的细胞凋亡。3讨论AL是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其克隆的白血病细
19、胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，细胞发育停滞于较早阶段9。化疗还是目前治疗AL的主要方法，固然大部分AL患者化疗后能够获得较高的缓解率，但化疗药物的不良反响较大，有时甚至危及生命，而且部分患者在获得完全缓解后会出现疾病复发或对目前传统的化疗药物有原发性耐药，预后极差。因而，探索新的靶向药物已成为当今AL亟待解决的问题。Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是细胞重要的MAPK通路之一，经常在生长因子、细胞因子及分裂素等刺激后被激活，介导细胞的分化、增殖、存活及原癌基因的转化。MAPK/ERK信号通路在人类恶性肿瘤中常被异常激活，在恶性肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。而且，30%以上恶性肿瘤患
20、者存在MAPK/ERK信号通路的基因突变，并在AL中发生更为频繁。Ras、Kit和Fms样酪氨酸激酶3Fms-liketyrosinekinase3，Flt3以及血小板衍生生长因子受体platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR等基因突变可导致MAPK/ERK信号通路的异常激活。MAPK/ERK通路的基因突变是不良预后的相关因子，与白血病化疗药物的耐药密切相关10。染色体易位产生的融合基因Bcr/Abl、融合基因TELtranslocationerythroblasttransformation-specificleukemia/PDGFR等可以激活该通
21、路。另外，某些化疗药物会诱发MAPK/ERK的级联反响，促进耐药的发生。因而，阻断MAPK/ERK通路有望加强传统化疗药物的疗效，克制耐药性，改善AL患者的预后。目前已经开发了针对Ras、Raf、MEK及ERK的抑制剂，并开场用于临床试验。固然这些抑制剂表现出了相应的疗效，但仍会发生复杂的并发症。RSK是位于MAPK/ERK信号通路下游的重要调控因子，通过对底物进行磷酸化而调节细胞核信号、细胞周期、细胞增殖、蛋白合成和细胞移行等1。研究发现，RSK1和RSK2在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤及骨肉瘤等多种实体肿瘤细胞中高表达，且伴有蛋白活性的增高；抑制RSK活性或敲除RSK1和RSK2的表达
22、可抑制实体肿瘤细胞的增殖。本研究发现，RSK1和RSK2mRNA在多种AL细胞中高表达；RSK抑制剂BI-D1870可抑制多种AL细胞的增殖，诱导Molt-4细胞凋亡并将其阻滞于G2/M期。固然在Nalm-6细胞中RSK1和RSK2mRNA的表达水平较低，但BI-D1870对Nalm-6细胞的增殖抑制率最高，笔者以为这可能与该细胞中RSK蛋白活性增高或其他机制有关，详细机制有待进一步研究。大多数化疗药物如：依托泊苷等主要是通过毁坏白血病细胞DNA的完好性，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤的作用14。然而，化疗药物造成的DNA损伤可激活细胞内DNA损伤应答信号通路，使受损的DNA得到及时修复，进而减弱化
23、疗药物的疗效或导致耐药的发生。完好的DNA损伤应答信号通路包括DNA损伤感悟复合物DNA损伤修复蛋白、毛细血管扩张性共济失调症突变激酶、Rad3相关激酶、DNA依靠性蛋白激酶、细胞周期检控点激酶、效应复合物和细胞分裂周期基因。研究发现，RSK可通过直接磷酸化细胞周期检控点激酶1的Ser280位点，改变细胞周期检控点激酶1在细胞内的位置或细胞周期检控点激酶1活性，促进肿瘤细胞的DNA损伤应答15。DNA损伤亦可激活RSK2，使其在细胞核内与毛细血管扩张性共济失调症突变互相作用，通过毛细血管扩张性共济失调症突变/p53信号通路，促进DNA损伤的修复16。本研究检测了BI-D1870联合依托泊苷对M
24、olt-4细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响，考虑到应用BI-D1870和依托泊苷IC50值的药物浓度处理细胞可能无法有效观察二者的协同效应，因而本研究选用BI-D1870和依托泊苷40%和60%IC50值的浓度处理细胞，发现BI-D1870联合依托泊苷可协同抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡。笔者揣测，通过抑制化疗药物所激活的DNA损伤应答反响可能是RSK抑制剂的作用机制之一。综上所述，RSK1和RSK2mRNA在多种AL细胞中呈高表达；RSK抑制剂能有效抑制856曹雨娜，等.RSK抑制剂BI-D1870对急性白血病细胞增殖的影响多种AL细胞的增殖，其机制可能与RSK抑制剂诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期有关；而且，BI-D1870联合化疗药物依托泊苷可协同抑制细胞的增殖，促进依托泊苷诱导的细胞凋亡。笔者揣测，RSK抑制剂BI-D1870可能是治疗AL潜在的分子靶向药物。