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1、试析肌肽对动物糖代谢【摘要】目的研究肌肽对应激负荷小鼠糖代谢的影响。方法将雄性KM小鼠分为正常对照组、应激对照组、150mg/kg及300mg/kg肌肽给药组，天天灌胃给药1次,连续给药7d后拘谨负荷应激20h灌胃葡萄糖2g/kg，检测血糖去除率、肝糖原合成能力、糖原合成酶基因表达及皮质酮水平。结果与应激负荷对照组比拟，肌肽能提高应激小鼠血糖消除速率，促进糖原合成酶的基因表达，并加强肝糖原合成能力。此外，肌肽还能降低血浆皮质酮的水平。结论肌肽加强应激负荷小鼠肝糖原合成能力，其作用机制可能与肌肽降低体内糖皮质激素水平、激活糖原合酶有关。【关键词】肌肽;拘谨应激;肝糖原;糖皮质激素近年来随着社会环
2、境及生活方式的改变，生活及工作的压力越来越大，由各种应激源导致的亚健康状态人数也逐年增加。人们长期处于应激负荷状态下容易导致免疫力下降，导致各种疾病的发生。肌肽是一种具备高效生物活性的天然二肽，广泛存在于哺乳动物的肌肉组织和神经组织中1。研究结果表明，肌肽具有抗氧化抗衰老功能、神经系统保护作用、抗糖基化作用、对肾中毒及肝损伤有一定的改善作用、可防止动脉硬化等生理活性2,3。但尚未见肌肽对应激负荷状态下糖代谢改善作用的报道。本实验通过观察肌肽对拘谨负荷小鼠血糖浓度和肝糖原合成的影响，以及小鼠血浆中皮质酮变化，讨论肌肽对应激引起的机体糖代谢紊乱的改善作用。1材料与方法1.1试剂肌肽(carnosi
3、ne)、皮质酮(corticoste?rone)标准品及氢化可的松(cortisol)标准品为美国Sigma公司产品;乙腈(色谱纯)为FisherScientific公司产品;乙酸乙酯和NaOH为广州化学试剂厂产品;葡萄糖购自天津药业;肝糖原试剂盒购自南京建成科技公司;葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业公司;Trizol购自广州英韦创津生物科技公司;逆转录系统PCR试剂盒均购自北京天根生化科技公司;PCR引物根据GenBank提供的基因序列使用PrimerDesign软件进行设计，引物均由英韦创津公司合成，糖原合酶?2(Gy?2)引物：5?AACGACAGCCGATGAGT?3(上游)，5?
4、CTGGCACGAGAAAGGAT?3(下游)，其扩增产物长423bp;以18s为内参：5?GGGAGAGCGGGTAAGAGA?3(上游)，5?ACAGGACTAGGCGGAACA?3(下游)，其扩增产物长241bp。1.2实验仪器高效液相色谱系统(日本HITACHI公司);MK3型酶标仪(Labsystem,Finland);3?18K型台式高速冷冻离心机(德国Sartorius公司);2720型PCR仪(美国AppliedBiosystems公司);电泳成像系统(美国Bio?RadLaboratories公司);MilliQPlus超级纯水仪(美国Millipore公司);电泳仪及水平电
5、泳槽为日本Mupid公司产品。1.3实验动物体质量1822g，6周龄SPF级雄性昆明种小鼠32只，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2008?0002。饲养温度(232)，照明时间12h/d(7001900)，饲养1周后进行实验。1.4动物分组及给药将小鼠随机分为正常对照组、拘谨应激对照组、150mg/kg及300mg/kg肌肽给药组，共4组，每组8只。肌肽给药组以0.1mL/10g灌胃给药，正常对照组和拘谨应激模型组均灌胃等量空白水，每日1次连续给药7d。除正常对照组外，所有小鼠均在末次灌胃后30min进行拘谨应激实验，小鼠拘谨装置参照文献4制作，为通风良好的50mL尖底聚丙
6、烯塑料离心管，给予一次性拘谨20h(12:00次日8:00)，拘谨期间小鼠不能进食饮水。正常对照组小鼠为禁食禁水小鼠。1.5小鼠糖耐受实验5上述各组实验动物在禁食和拘谨结束30min后灌胃葡萄糖2g/kg，口服葡萄糖后0、20、40、60及80min尾静脉取血于肝素钠小离心管中，5000r/min5min离心，取血浆用葡萄糖测定试剂盒测定血糖浓度。1.6HPLC测定小鼠血浆皮质酮的含量取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5000r/min离心5min分离血浆。取0.5mL血浆，并添参加2mL乙酸乙酯振摇萃取，分离得到上层乙酸乙酯液，下层水液再用乙酸乙酯萃取1遍，合并乙酸乙酯液后用0.1mLN
7、aOH洗1次，再用蒸馏水洗2次。乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后参加100L流动相(乙腈水=3872，体积比)溶解即得皮质酮分析样品溶液。按Woodward等人的方法，采用HPLC内标法(内标物为cortisol)测定血浆中皮质酮含量6。检测条件为：紫外检测，检测波长为254nm;色谱柱：5C18(4.6mm150mm，5m);流动相：乙腈?菜?(38%72%);流速：1mL/min。1.7肝糖原合成测定测定血糖浓度后，小鼠在乙醚麻醉下取出肝脏，按肝糖原试剂盒方法测定肝糖原含量。1.8半定量RT?PCR检测Gy?2mRNA的表达取肝脏组织，用Trizol提取总RNA，逆转录反响以总RNA3g为模
8、板，总反响体系20L，42水浴1h合成cDNA。PCR反响条件设置：94预变性5min，94变性30s，60退火40s，72延伸50s，进行30次循环，最后72延伸7min，同法以18s为内参进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，Bio?rad凝胶成像系统记录结果，QuantityOne软件进行灰度分析。结果以Gy?2与内参照物18smRNA扩增片段灰度值的比值表示Gy?2mRNA相对水平。1.9数据统计与分析实验数据以(s)表示，采用SPSS软件，利用ANOVA检验进行统计学处理，P0.05为差异有显著性。2结果2.1肌肽对拘谨负荷小鼠糖耐受的影响结果见表1、图1。口服2g/kg葡
9、萄糖后与正常对照组相比，拘谨应激小鼠的血糖浓度上升明显，在20、40和60min时具有统计学差异。与应激对照组相比(P0.01)，肌肽高低剂量给药组均能使应激小鼠血糖浓度明显降低，提高糖耐受能力，结果表明肌肽能提高应激小鼠血糖消除速率。表1肌肽对拘谨应激小鼠糖耐受的影响与正常对照组比拟：*P0.05，*P0.01;与应激对照组比拟：P0.05，P0.012.2肌肽对拘谨负荷小鼠血浆皮质酮水平及肝糖原合成的影响结果见表2，与正常对照组相比，拘谨应激使小鼠血浆皮质酮水平显著上升(P0.01)，肝糖原合成能力显著下降(P0.01)。与应激对照组相比，肌肽高低剂量给药组均能降低拘谨应激引起的血浆皮质酮
10、上升(P0.01)，促进肝糖原的合成(P0.05)。2.3肌肽对拘谨应激小鼠糖原合成酶表达的影响目的基因Gy?2(糖原合成酶)与内参基因18s的RT?PCR扩增产物的A目的基因/A内参基因能反映Gy?2基因的转录水平，比值越大，Gy?2转录水平就越高。如图2和图3所示，与正常对照组相比，拘谨应激后Gy?2的表达明显降低，与空白对照组比拟差异非常显著(P0.01)。高低肌肽给药组Gy?2的表达明显升高，与拘谨应激组比拟差异显著(P0.05)。表2肌肽对拘谨应激小鼠血浆皮质酮水安然平静肝糖原合成的影响3讨论机体在应激负荷时激活交感神经?采錾舷偎柚氏低常?产生大量儿茶酚胺、兴奋性氨基酸，导致下丘脑?
11、泊固濯采錾舷僦?(HPA)功能亢进,血液中皮质醇浓度增高7。糖皮质激素的释放增加，促进糖原分解和糖异生作用，抵制外周组织对葡萄糖的转运和利用，快速升高血糖8。实验结果表明，小鼠拘谨应激20h口服葡萄糖后血糖浓度显著升高，血糖值在20、40、60min时显著增加。150、300mg/mL肌肽给药能降低拘谨应激小鼠血糖浓度，改善因应激负荷导致的血糖利用率低下。同时150、300mg/mL肌肽给药能显著降低拘谨应激小鼠血浆皮质酮水平，促进肝糖原合成，降低糖皮质激素水平，加强葡萄糖的储备，改善了机体应激后导致的能量供给缺乏的状况。糖原合酶(glycogensynthase,Gys)是肝和肌肉糖原合成的
12、关键限速酶，其中糖原合酶?2(Gy?2)主要存在于肝脏中，调节肝糖原的合成。糖皮质激素通过调控cAMP和Ca2+这2个信号分子，激活糖原合成酶激酶使糖原合成酶磷酸化而活性降低9,10。本实验结果表明150、300mg/mL肌肽给药能够促进Gy?2mRNA表达，提高肝糖原合成能力，其机制可能与肌肽能显著改善机体糖皮质激素水平，激活糖原合成酶激酶，继而使糖原合成酶去磷酸化被激活有关。新晨肌肽作为一种新型高效天然抗氧化肽遭到了国内外普遍关注，肌肽不仅具有抗氧化，抗糖基化，提高免疫力和缓解老年性疾病等作用，而且近年来肌肽药物已经开发应用于临床。本研究结果显示肌肽能显著提高拘谨应激小鼠血糖利用率，降低血浆皮质酮水平，促进肝糖原合成能力及改善机体能量利用缺乏等作用，为肌肽的应用与开发提供一定的实验根据。