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1、穿膜肽的原核表达及穿膜效果（中国畜牧杂志）2014年第十期1材料与方法1.1实验材料DNAMarker、BL21DE3感受态细胞购自TIANGEN、限制性内切酶BamH和Hind、T4DNAligase购自TaKaRa，IPTG购自Solarbio，标准蛋白分子Marker购自Fermentas，溶菌酶、透析袋购自上海生工，尿素购自BioBasicInc.，咪唑购自Sigma-Alorich，HisTrapHP层析柱购自GEHealthcareLifeScience。1.2基础载体pET-TAT的构建根据NCBI，TAT序列GenBank：AF525447为tacggtcgtaaaaaacgt
2、cgtcagcgtcgtcgt，人工合成后插入pET-32a+酶切位点SalI和XhoI之间。把pET-32a+质粒改造为pET-TAT基础表达载体，由金思特科技南京有限公司完成。1.3原核表达载体pET-EGFP的构建用限制性内切酶BamH和Hind进行双酶切重组质粒pMD18-T-EGFP和载体pET-32a+，胶回收目的片段EGFP，T4连接到线性pET-32a+，构建成表达载体pET-EGFP。1.4原核表达载体pET-NLS-EGFP-TAT的构建根据EGFP序列，使用Oligo6.0设计N端加有核定位NLS序列的引物，上游引物：5-CGCGGATCCCCGAAAAAGAAACGTA
3、AAGTTACCATGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，下游引物：5-CCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3，其中下划线-部分分别为BamH和Hind的酶切位点，下划线波浪线部分为核定位NLS序列。以pMD18-T-EGFP重组体为模板进行PCR扩增得到NLS-EGFP，然后进行TA克隆、酶切、连接到pET-TAT基础表达载体上，构建成原核表达载体pET-NLS-EGFP-TAT。1.5蛋白EGFP和NLS-EGFP-TAT的诱导表达将原核表达载体pET-EGFP和pET-NLS-EGFP-TAT分别转化大肠杆菌BL21DE3，当菌液浓度生长到OD
4、值在0.60.8之后，添加IPTG终浓度为0.2mmol/L，37、220r/min摇床诱导4h，取样进行SDS-PAGE分析。然后对阳性菌液进行大摇，离心收集菌液沉淀，再用溶菌酶消化、超声波破碎菌体，得到粗制包容体，再用含有1mol/L尿素的包容体洗涤液超声洗涤包容体。1.6融合蛋白的纯化与复性洗涤后的包容体，参加结合缓冲液，冰上充分冷却，再4离心，收集上清液再用0.22m滤膜过滤得到蛋白上柱样品，然后将上柱样品通过HisTrapHP层析柱，再用结合缓冲液洗去未结合上柱的蛋白及杂质，然后用复性缓冲液在层析柱上复性融合蛋白，含有咪唑的洗脱缓冲液洗脱融合蛋白，得到纯化蛋白溶液。将纯化蛋白溶液放入
5、透析袋中，用MilliQ水中4透析，除去咪唑等，然后再在透析袋外表撒上PVP进行浓缩蛋白。1.7细胞培养验证穿膜功能水牛成纤维细胞接种培养24h后，更换培养液，然后在新的培养液中分别添加纯化的EGFP蛋白100g/mL和NLS-EGFP-TAT100g/mL蛋白，继续培养58h，在添加NLS-EGFP-TAT纯化蛋白时，为了加强TAT的穿膜效果，同时在培养液中添加HA2-TAT蛋白。培养规定时间后，再用PBS充分洗涤细胞，然后在激光共聚焦显微镜下观察EGFP蛋白分布状态。2结果2.1原核表达载体的构建与鉴定双酶切质粒pMD18-T-EGFP和载体pET-32a+，得到EGFP片段，T4连接到线
6、性pET-32a+上，构建为原核表达载体pET-EGFP，经酶切和PCR鉴定，结果与实验设计相符，见图1和图2。通过引物带入方式，PCR扩增得到NLS-EGFP片段，再经过TA克隆、酶切、连接到pET-TAT基础表达载体上，构建为表达载体pET-NLS-EGFP-TAT，经酶切和PCR鉴定，结果与实验设计相符图3和图4。2.2融合蛋白的诱导表达由图5可知，含有pET-EGFP和pET-NLS-EGFP-TAT的阳性BL21DE3菌液，经IPTG诱导后，分别在47.3ku和50.1ku处有特异性条带，与预期相符。2.3融合蛋白穿膜功能的初步检测水牛成纤维细胞在添加EGFP蛋白共培养后，细胞的生长
7、状态并无影响，EGFP蛋白仍然散落在细胞培养液中；充分洗涤细胞后，并未观察到细胞外表和细胞内有绿色荧光图6。水牛成纤维细胞在添加了NLS-EGFP-TAT蛋白和HA2-TAT蛋白共培养后，能够观察到NLS-EGFP-TAT蛋白很快吸附在细胞外表，在培养58h后，用PBS充分洗涤细胞3次，除去培养中多余的未穿膜蛋白，然后在激光共聚焦下能够观察到细胞内均匀分布有荧光，讲明NLS-EGFP-TAT蛋白已内化入细胞图7。3讨论Yamanaka等利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个因子Oct4、Sox2、cMyc、Klf4，并用多能性标志分子Fbx15进行挑选，得到了iPS细胞，在这短短的几年
8、时间里，iPS细胞技术得到了迅速发展。但是这些iPS细胞的诱导方法大多数都是采用病毒载体、转座子等，这些方法主要是采用了基因操作的原理来启动细胞的重编程，可能导致基因插入突变，具有潜在的不安全性。随后产生了更为安全可靠的方法，包括质粒转导、小分子化合物诱导、蛋白诱导等等。其中蛋白诱导的方法充分利用了中心法则，采用干细胞转录因子的重组蛋白，利用细胞穿膜肽的作用将蛋白分子载入细胞内，进而启动细胞重编程，获得了安全性很高的iPS细胞。而采用蛋白诱导的方法想得到iPS细胞，关键是怎样顺利的将大分子物质蛋白质导入细胞内，并且定位于细胞核内作用于细胞DNA，充分的发挥其功能。因而本试验重在引入细胞穿膜肽，
9、将其与干细胞转录因子进行融合表达，进而获得具有自主穿膜功能的重组蛋白。Frankel等发现，从HIV-1humanimmunodeficiencyvirus1中纯化出来的含有86个氨基酸残基的反式活化因子蛋白TAT蛋白trans-activatorprotein，tat-86能够快速地顺利穿过细胞膜。Vives等的研究表明，在TAT蛋白86个氨基酸残基中，只需要其中的11个氨基酸残基tat：47-57，组成为YGRKKRRQRRR，即具有穿膜能力；并且揣测其内化经过并不是依靠传统的胞吞形式，以及非温度依靠性。在对自然界存在的几种穿膜肽TAT、ANTP和VP22的研究中，富含Arg、Lys等碱性
10、氨基酸残基，带有大量正电荷，以及具有-螺旋构造，而这些Arg和Lys就是影响其穿膜功能的必须氨基酸残基。穿膜肽TAT的穿膜机制，目前还没有一个公认的形式，但是基于CPPs的分子构造以及众多的实验验证表明，CPPs首先是通过其-螺旋外表的正电荷与细胞膜外表的负电荷物质比方肝素、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖等等发生静电吸附，大量积聚在细胞外表，随后由于某种机理而启动的巨胞饮macropinocytosis通过不同的内化途径internalizationpathways进入细胞。采用蛋白诱导的方法顺利得到水牛iPS细胞，另一个关键技术是怎样将进入细胞内的干细胞转录因子活化蛋白定位于细胞核内。但是，对于穿膜
11、肽TAT能否能将携带的外源蛋白进行亚细胞定位，在诸多的文献报道中也各执一词。对于大分子蛋白质要进出细胞核，现论以为其必须通过载体蛋白才能顺利穿过核孔复合物nuclearporecomlex，NPC进入核内，而NLSnuclearlocalizationsignal序列则能够帮助大分子蛋白质与载体蛋白质结合成为聚合物，并提高其穿核效率。不同蛋白质转运所依靠的NLS有所差异，并且其作用机制也不尽一样。根据Yoshikawa等的研究结果，融合表达NLS序列氨基酸残基序列为PKKKRKVTMA，能够准确地将目的蛋白VENUS-TAT定位于细胞核内。本实验借鉴其方式，在引物中合成NLS序列，将其与EGF
12、P-TAT蛋白融合表达，期望能够使融合蛋白穿膜后因而具有细胞核内定位功能。从本实验结果中，能够清楚地观察到单独添加EGFP蛋白只是分散在培养液中，并未发生细胞吸附现象，也未能在胞内检测到荧光。而在细胞培养液中添加的NLS-EGFP-TAT蛋白，很快吸附在细胞外表，同时在培养液中添加了HA2-TAT蛋白，能够帮助NLS-EGFP-TAT蛋白在完成细胞内化后，能够顺利地从内含体中逃逸出来，避免被溶酶体降解掉，因而在细胞内能够检测到荧光。但是NLS序列的引入，在试验结果中并未有明显的体现出来。由于蛋白质在复性折叠时，各组成构造互相影响的原理比拟复杂，可能会直接造成蛋白质分子在构象修饰经过中，掩盖了NLS构造，进而未能发挥出其较强的核定位功能。4结论本实验成功的对EGFP蛋白和NLS-EGFP-TAT蛋白进行了原核表达，并添加到水牛成纤维细胞中进行共培养，能够确定融合了TAT的EGFP蛋白能够在TAT的帮助下顺利进入细胞内。但想要进一步的将EGFP蛋白准确定位到胞核内，还需进一步的讨论更适宜的NLS序列及其在原核表达后蛋白折叠构象对其功能的影响，这样才能为后续的制备蛋白诱导水牛iPS细胞奠定基础。