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1、人结肠癌细胞恶性表型的影响（医学研究生学报）2014年第六期1材料与方法11细胞转染体系建立及实验分组HT-29和HCT-116细胞株转染方法按Lipofectamine2000产品讲明书进行。转染前1d将细胞分别以1105个/孔、5104个/孔的密度接种于24孔板中，使转染前细胞融合率到达60%70%。转染时设定脂质体的浓度分别为05、1、15L，并将其稀释于PMI1640或DMEM培养基50L，pGPH-shFoxM1及其阴性对照pGPH-shNC的浓度分别为:05、1、2、4g，稀释后脂质体静置5min，与同样用培养基50L稀释的质粒混合，静置20min，分别参加24孔板中。转染6h后更
2、换新鲜培养液继续培养，4872h后荧光显微镜观察转染效率。HCT-116、HT-292种细胞株均分为3组，详细如下述:空白对照组(不转染组);实验对照组:转染相应空载质粒(pGPH-shNC及pEX-2-NC);实验组:转染FoxM1干扰质粒及FoxM1过表达质粒。12荧光实时定量(realtimePC，T-PC)法检测FoxM1基因表达水平取各组转染后24h细胞，采用Trizol提取总NA，经Dnase酶消化基因组DNA后，采用TAKAA公司的反转录试剂盒(Prime-Script1stStrandcDNASynthesisKit)进行cDNA的反转录，方法参照试剂盒讲明书。同时采用TAKA
3、A公司的定量试剂盒(SYBPremixExTaq)进行T-PC检测，反响体系参考试剂盒讲明书。PC反响条件为95，10s;60，10s;72，10s;共40个循环。读取CT值，采用CT法进行数据分析。FoxM1的定量引物为:正义链:5-AACCGCTACT-TGACATTGG-3，反义链:5-GCAGTGGCTTCATCTTCC-3。GAPDH的定量引物为:正义链:5-TGTTGCCAT-CAATGACCCCTT-3，反义链:5-CTCCACGACGTACT-CAGCG-3。13Westernblot方法检测FoxM1蛋白表达水平提取转染72h后各组细胞的总蛋白，并进行蛋白定量，按（分子克隆实
4、验指南）11所述方法配制SDS-PAGE分离胶(12%)和浓缩胶(5%)，待胶凝固后每孔上样30g蛋白，常规电泳、转PVDF膜、显像。利用图像分析仪对胶片显像条带进行灰度分析，以内参照-actin进行校正。14划痕愈合试验取对数生长期稳定的转染细胞，细胞接种于包被Collagen的6孔板，置37细胞培养箱中孵育过夜后回收Collagen，再将培养板在培养箱中枯燥过夜，培养至细胞呈现出单层贴壁生长状态。分别在各组单细胞层上划痕，用含10%FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0、12、24、48h每个孔取4个视野拍照，在倒置显微镜下观察划痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。15Trans
5、well侵袭试验取对数生长期稳定转染细胞，用无血清PMll640培养过夜。通过24孔趋化小室和matrigel胶检测细胞侵袭性。结果表示为穿过matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数，显微镜下每个复孔取5个高倍镜视野计数(400)，计算平均值。16统计学分析采用SPSS170软件进行统计分析。定量结果以均数标准差(xs)表示，两组间均值比拟采用t检验，多组之间均数比拟采用单因素方差分析(ANOVA)。以P005为差异有统计学意义。2结果212株人肠癌细胞系的FoxM1表达分析T-PC及Westernblot检测均显示，FoxM1在HT-29细胞中表达水平较HCT-116高。见图1。22HT-29
6、和HCT-116转染体系的建立采用pGPH-shNC(FAM)空载体转染HT-29和HCT-116细胞48h后检测荧光信号，根据荧光强度检测转染效率，进而建立高效的HT-29和HCT-116转染体系。结果表明，脂质体为1L/孔，pGPH-shNC(FAM)浓度2g/孔时，共培养48h为最佳的转染条件。见图2。23FoxM1基因对HT-29和HCT-116侵袭性的影响为研究FoxM1的表达对人结肠癌细胞的调控，本研究基于优化的HT-29和HCT-116转染体系，应用NA干扰技术有效下调FoxM1在HT-29细胞中的表达，同时采用过表达质粒调高HCT-116中FoxM1表达水平，24h后提取NA，
7、72h后提取蛋白。T-PC检测结果表明HCT-116细胞株中过表达FoxM1后其mNA的表达水平显著上调，采用pGPH-shFoxM1转染HT-29细胞后，FoxM1表达水平显著下调。Westernblot结果亦表明，FoxM1蛋白在HT-29中成功下调，在HCT-116中成功上调。见图3。231划痕愈合实验转染pGPH-shFoxM148h后，HT-29的增殖能力明显遭到抑制，愈合率仅为(1037386)%，与HT-29实验对照组(42020)%及HT-29空白对照组(37022)%相比差异具有统计学意义(P005)。而在HCT-116细胞中上调表达FOXM1后，愈合率提高至(7092148
8、)%，表示增殖力明显得到了提高，与HCT-116实验对照组(1843301)%及HCT-116空白对照组(6736261)%相比差异具有统计学意义(P005)。见图4。232Tanswell小室检测细胞侵袭能力HT-29和HCT-116肠癌细胞接种在Matrigel胶铺被的transwell小室中48h之后，HCT-116实验组平均穿膜细胞数(186068)个较HCT-116实验对照组(42020)个和HCT-116空白对照组(37022)个升高，差异有统计学意义(P005);HT-29实验组平均穿膜细胞数(53018)个较HT-29空白对照组(118040)个和HT-29实验对照组(9502
9、2)个降低，差异有统计学意义(P005)。见图5。3讨论FoxM1介入细胞增殖、凋亡以及人体多种器官发育4。FoxM1仅表达于高增殖状态的细胞中，如所有胚胎组织，十分是上皮和间质的增殖细胞中;在人体组织中，FoxM1仅高度表达于胸腺和睾丸组织，中度表达于肺和肠道12。恶性肿瘤的发生正是由于在致癌因素作用下，遗传物质发生改变导致细胞增殖信号过度活化。研究发现，FoxM1常高表达于肝癌13、前列腺癌、胃癌15等多种恶性肿瘤中，同时，它与多种癌基因信号转导途径相关16，包括表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGF)信号通路、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(ph
10、osphoinositide3kinese/proteinkinaseB，PI3K/Akt)信号通路、核转录因子B(nuclearfactor-kappaB，NF-B)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)信号通路、细胞外信号激酶(extracellularsig-nal-regulatedkinase，EK)信号通路、蛋白酶体通路等。特异性FoxM1抑制剂在肿瘤治疗方面的研究提示FoxM1极有希望成为一个新的抗癌靶点。在肝细胞癌(hepaticcellulercancer，HCC)中，FoxM1是EK的主要效应器。FoxM1b在H
11、CC小鼠模型及HCC细胞系中，均有高表达。其表达增高与EK正相关，可促进HCC的肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞凋亡。相反，抑制FoxM1b表达，可下调EK激活水平，减少HCC细胞株的血管构成，促进细胞凋亡。FoxM1c可加强细胞增殖的关键因子cyclinE/Cdk2的表达，后者被以为是c-myc基因的反式激活启动子4。有学者在胃癌细胞株研究中发现，c-myc是FoxM1调控的下游基因。国内外研究发现，FoxM1和NF-B在细胞分化、细胞周期、细胞增殖、细胞死亡、细胞迁移等生物学行为中发挥重要作用，但两者之间的互相作用机制仍需进一步说明。Ma等发现，af/MEK/MAPK的激活对于FoxM1核转移不
12、可或缺，同时，可促进FoxM1与cyclinB1之间交互作用，继而促进细胞的有丝分裂。应用af/MEK/MAPK抑制剂U0126后，FoxM1表达显著受抑，并使细胞停滞于G2/M期。综上所述，FoxM1表达失调与多种细胞增殖、凋亡等进程相关细胞因子及信号转导通路均相关，已成为研究肿瘤发生、发展经过中的新热门分子。本研究在细胞水平探索了FoxM1表达水平变化对结肠癌细胞的体外运动和侵袭性。首先针对FoxM1基因设计了3条不同的siNA干预序列，优化siNA转染条件后应用不同的siNA对细胞进行转染，最终选定抑制效果最强的FoxM1siNA。继而根据该序列合成干扰表达质粒pGPH-shFoxM1。
13、应用T-PC及Westernblot检测，提示FoxM1在HT-29细胞中高表达，而在HCT-116细胞中呈低表达。进一步在细胞水平探索了FoxM1表达对结肠癌细胞的体外运动和侵袭性的影响。采用NA干扰的方法下调结肠癌细胞HT-29中FoxM1表达水平并采用过表达质粒调高HCT-116中FoxM1表达，利用划痕实验和细胞侵袭实验讨论FoxM1对结肠癌细胞生长和侵袭能力的影响。结果显示NA干扰可使FoxM1表达下调，下调FoxM1表达可抑制细胞的迁移能力和侵袭性。反之，过表达质粒可有效调高FoxM1表达水平，上调FoxM1表达可提高细胞的迁移能力和侵袭性。本研究与Kalinichenko等研究结果类似，抑制FoxM1表达可显著抑制肝癌等多种细胞的迁移能力和增殖性。这些结果均为寻找新的治疗靶点提供了有力的根据。总之，FoxM1对结肠癌细胞增殖和侵袭能力具有重要的影响，具有发展成新型结肠癌治疗靶位的潜力。