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1、EPSP合酶的研究进展（生物技术通报杂志）2014年第七期1莽草酸途径简介莽草酸途径是存在于植物、细菌和真菌中的一条重要代谢途径，而动物体内的代谢中是不存在此途径的，此途径使糖代谢和次生代谢严密地联络在一起。该途径有7个酶介入催化反响，并且这7个酶都能够通过真核和原核细胞来源的基因表达获得。第一步反响是磷酸烯醇式丙酮酸PEP和赤藓糖-4磷酸E4P的反响。PEP和E4P分别是由糖酵解途径和戊糖磷酸途径产生的物质。最后一步反响是分支酸的生成。分支酸不仅是莽草酸途径的终产物，也是3种芳香族氨基酸和一些次生代谢产物的主要前体。分支酸的去向如图1所示。植物的次生代谢产物合成途径包括苯丙烷代谢途径、异戊二
2、烯代谢途径和生物碱合成途径等。研究表明，很多次生代谢产物的芳香族氨基酸前体都是来自莽草酸途径产生的芳香族氨基酸及其中间产物，因而莽草酸途径在合成有商业价值的天然产物经过中起着非常重要的作用。莽草酸途径在植物中的重要性也得到证明，由莽草酸途径产生的物质大约占植物干重的35%以上。由于莽草酸途径在哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物和昆虫中是不存在的，近年来它逐步成为抗菌素、除草剂和活体疫苗的靶标。例如，由恶性疟原虫引起的疟疾，每年大约200多万人死于这种疾病，科学家利用莽草酸途经寻找新型的抗疟疾药，目前草甘膦作为疟疾的疗效药已经在小鼠身上成功试验。2EPSP合酶的分类、细胞中定位及不同组织中的分布目前
3、EPSP合酶被分为两种类型，类型I包括来源于大肠杆菌Escherichiacoli和鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium的EPSP合酶；类型II包括来源于覆盆子土壤杆菌Agrobacteriumtumefacienssp.CP4、无色杆菌Achromobactersp.LBAA、假单胞菌Pseudomonassp.PG2982等。类型II的EPSP合成酶多克隆抗体与类型I的EPSP合酶不会发生抗原抗体穿插反响，而且两种类型序列一致性30%左右。I型EPSP合酶对除草剂草甘膦敏感。II型EPSP合酶在草甘膦存在时，相对于I型EPSP合酶表现出更高的催化效率。研究人员将II型E
4、PSP合酶转入作物中能够对除草剂产生抗性，显著有效的控制了田间杂草。目前已知的II型EPSP合酶都是在微生物中存在的。在今天市场上销售的大多数耐草甘膦产品都含有农杆菌CP4-EPSPS。Della-Cioppa等发如今植物细胞中，前体EPSP合酶存在于细胞核中，但是当该酶变为成熟的EPSP合酶Matureenzyme时，是存在于叶绿体内。EPSP合酶是通过前体EPSP合酶合成的。绝大多数植物的EPSP合酶的活性中心存在于叶绿体中。前体EPSP合成酶也具有催化活性，并且它的催化活性也遭到草甘膦的抑制。前体EPSP合酶的N端为信号肽所在的位置。信号肽的主要作用是引导EPSP合酶进入叶绿体基质，之后
5、信号肽被水解，前体蛋白就变成成熟的EPSP合酶。例如，童旭宏等发现陆地棉EPSP合酶基因编码521个氨基酸残基，前74个氨基酸残基为运输肽，当前体EPSP合酶进入叶绿体后经加工剪切信号肽，变成成熟EPSP合酶。成熟EPSP合酶包含447个氨基酸，比前体EPSP合酶氨基酸少了74个氨基酸，分子量约为48kD。信号肽对于EPSP合酶定位于叶绿体起着决定性的作用。微生物的EPSP合酶存在于细胞质中，并且没有一段氨基酸序列在N端，所以微生物EPSP合酶无信号肽。我们通过转基因技术把微生物的EPSP合酶基因导入植物中固然能够成功表达EPSP合酶，但是不能进入叶绿体，假如加上信号肽序列，就能把表达的EPS
6、P合酶定位到叶绿体上。植物中的EPSP合酶主要存在叶片、根、顶端分生组织、嫩叶和胚芽鞘中，叶片中合成大量的芳香族氨基酸，而在根、顶端分生组织、嫩叶和胚芽鞘中既能够本身合成，也能吸收叶片中的芳香族氨基酸。3EPSP合酶的三维构造与活性区Krekel等成功纯化出大肠杆菌的EPSP合酶。通过对此酶核磁共振及晶体衍射研究分析发现，其合酶由两个构造域组成，每个构造域包含3个一样的折叠单位，每个折叠单位由两个平行的螺旋和4个折叠组成图2。研究人员发现大肠杆菌EPSP合酶共有427个氨基酸残基，PEP结合位点与Lys-22、Arg-124、Asp-313、Arg-344、Arg-386和Lys-411这6个
7、氨基酸残基有关，Arg-27与莽草酸-3-磷酸S3P结合位点有关。EPSP合酶蛋白的N端和C端都在同一个构造域中，PEP主要与EPSP合酶的C端构造域结合，而S3P与EPSP合酶主要结合在N端构造域29-31。两个平行的螺旋在两个构造域间构成了能够吸引负电荷基团的正电荷区。EPSP合酶存在状态分为两种：一种是开放Open状态图3-a，当没有底物与合酶结合，且两个构造域相距较远时存在的状态；当酶与底物S3P结合时，两个构造域互相靠近，并且在两个构造域之间裂缝中出现酶的活性位点，这时合成酶存在的状态为关闭Closed状态图3-b。在关闭状态下，采用限制性胰消化酶也很难使其消化，在开放口的90-10
8、2位氨基酸及附近的1区123-134位氨基酸、2区140-152位氨基酸、3区355-366位氨基酸与底物结合，进而避免了这些区域被消化，通过这个试验确定了EPSP合酶的活性区域。假如将EPSP合酶与底物结合区域的某些氨基酸残基替代，如将Gly96改为Ala、Pro101改为Ser，则草甘膦就很难与合酶结合，这时该酶表现出耐草甘膦的特性。易弋等对盐藻的EPSP合酶三级构造进行预测并对氨基酸序列进行多重比对发现，盐藻EPSP合酶的氨基酸序列与高等植物、细菌一样，都有开放和关闭两种状态，并且都含有3处氨基酸序列非常保守的区域，这些非常保守的区域就是EPSP合酶与酶底物PEP、S3P或草甘膦结合的活
9、性位点，假如改变保守区域中的一个位点，那么酶的活性将会改变，草甘膦的抑制作用也会减弱。研究人员发现细菌和植物的EPSP合酶是一个单体酶，分子量大约为44-48kD。而真菌的EPSP合酶属于AROM蛋白构造域中的其中一个，AROM蛋白通常是以二聚体形式存在的，单体形式下没有催化活性，分子量比拟大，最多含有1618个氨基酸，最少含有1563个氨基酸，而且AROM蛋白是一个同时具有脱氢奎尼酸合酶、脱氢奎尼酸脱水酶、莽草酸脱氢酶、莽草酸激酶和EPSP合酶活性的5功能多肽，催化真菌中芳香族氨基酸合成途径的第3步到第6步的反响。4EPSP合酶的催化机制EPSP合酶作为莽草酸途径的第6位酶，介入合成芳香族氨
10、基酸苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸和很多次生代谢产物，如泛醌Ubinquinone，维生素KVitamink，维生素K2类Menaquinone等。EPSP合酶催化烯醇式丙酮酸基团从PEP转化到S3P上构成产物EPSP，并释放出一分子无机磷，这个化学反响是PEP的C-O键裂解而不是经过P-O键的裂解，并且在PEP上发生乙烯基质子的交换。之前有研究者以为合酶与底物的结合是随机的，但是通过用动力学优化的底物诱导试验证明了酶与底物结合是有先后顺序的。1988年，Wibbenmeyer等将大肠杆菌EPSP合酶纯化，当纯度到达97%以上时，通过核磁共振NMR和快速淬火动力学Raidquenchkinetics
11、方法得到了EPSP合酶催化S3P和PEP的反响是一个缩合反响，EPSP合酶和S3P及PEP构成了一个四面体过渡态，并伴随着生成一个EPSP缩酮副产物，过渡态随后生成EPSP并释放一分子无机磷图4-a。1997年，Studelska等利用固体核磁共振Solid-stateNMR方法对EPSP合酶的催化机理重新进行了研究，发现PEP首先和EPSP合酶构成过渡态A、B，之后与S3P结合构成合酶缩酮过渡态C，而后生成EPSP图4-b，这种催化机理也得到了研究者的证明。5EPSP合酶基因及表达目前已经从细菌，真菌和植物中分离克隆出很多EPSP合酶基因。在原核生物中，很多EPSP合酶基因被克隆与分析。19
12、84年，Duncan等44，47初次克隆出长度为1284bp，编码427个氨基酸残基的E.coliEPSP合酶基因，并且该基因内没有内含子。Comai等对鼠伤寒沙门氏菌SalmonellavtyphimuriumEPSP合酶基因进行克隆发现，基因编码427个氨基酸，合酶蛋白的分子量约为46kD。有研究者对大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合酶基因进行了比照发现，二者的核苷酸序列差异为21%，同义密码子有78%在第1位或第二位碱基上发生变化，65%在第3位碱基上变化，氨基酸序列的同源性为93%，并且两种多肽的15个N端氨基酸残基也是一样的，在86-131位氨基酸之间的区域为高度保守区域，而在30
13、2-371和381-422位氨基酸之间的区域为C端高度保守区域。脯氨酸分别位于这两种合酶序列中的不同位置，位于鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶序列的85位上，而在大肠杆菌中位于合酶序列的81位上，并且在81-85位的氨基酸残基在鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶序列中是不存在的，两者其它部位的脯氨酸是完全保守的。在真菌中，很多EPSP合酶基因也被克隆与分析。Charles等报道了真菌构巢曲霉Aspergillusnidulans的EPSP合酶基因，其合酶属于AROM蛋白构造域中的其中一个，基因中含有一个单一的阅读框架，长度为5311bp。于海涛等克隆分离得到了假丝酵母TY-JM和黄曲霉TZ1985的EPSP
14、合酶蛋白编码序列。假丝酵母TY-JM的EPSP合酶编码序列长度为1311bp，编码436个氨基酸，理论分子量为46kD，黄曲霉TZ1985的EPSP合酶编码序列长度为1353bp，编码450个氨基酸，理论分子量为48kD。通过与其它物种EPSP合酶氨基酸序列比照分析，TY-JMEPSP合酶基因与杜氏假丝酵母、热带假丝酵母和白假丝酵母等物种的同源性为80%，而与棒曲霉、核盘菌的同源性为66%，TZ1985EPSP合酶基因与土曲霉、烟曲霉、白曲霉和黑曲霉的同源性为90%，而与白假丝酵母、杜氏假丝酵母和热带假丝酵母的同源性为68%。在进化关系上，TY-JMEPSP合酶和TZ1985EPSP合酶与真菌
15、的EPSP合酶有很近的亲缘关系，而与植物和细菌的EPSP合酶亲缘关系比拟远。在植物中，一些EPSP合酶基因也被克隆与分析。Wang等发现烟草中有两种EPSP合酶基因的cDNA，两种cDNA的长度分别为2000bp和1300bp，二者编码的氨基酸序列和核苷酸序列的同源性分别为95.9%和89%，但是两种EPSP合酶的酶活力一样。刘晓军等从诸葛菜中也克隆出两段EPSP合酶基因片段，其中一段长为797bp，另一段长为1157bp，两个片段的外显子序列是完全一样的，内含子相差很大，但是这两段基因编码出一样的EPSP合酶，这两个片段所编码氨基酸序列与欧洲油菜、玉米、拟南芥、黑麦草、水稻及矮牵牛的一致性分
16、别为85%、80%、83%、80%、79%和79%。Gasser等通过比照细菌、植物和真菌的EPSP合酶编码区，获得了一个比拟一致的形式图5，三者EPSP合酶中约有38%的氨基酸残基一样，细菌和植物之间EPSP合酶的同源性为54%，真菌和植物之间EPSP合酶的同源性为38%，这些数据表明真菌和植物中的EPSP合酶的分枝比细菌和植物中此酶的分枝出现的早。研究者发现EPSP合酶基因在生物不同的组织中表达也是有差异的，在矮牵牛中其基因表达量最高的组织是花瓣，在银杏中表达量最高的是在果实和叶子中；其次为茎，最低的是在根中。木本植物喜树EPSP合酶基因表达量最高的组织是在叶子，根中表达量最低。薤白EPS
17、P合酶基因在幼叶中表达量最高，而在壮叶和茎中表达量最低。出现这种表达差异的原因可能是由于EPSP合酶基因在不同的组织中发生转录的起始位点不一样，也有研究者以为黄酮含量也与不同组织中EPSP合酶基因的表达量有关。另一方面，有研究者报道，改变高度保守区域的氨基酸残基，可使EPSP合酶与草甘膦的结合能力发生改变，进而使生物表现出抗草甘膦特性。6EPSP合酶基因的应用EPSP合酶不仅是除草剂草甘膦作用的靶标，可以以作为抗菌素和抗寄生虫药物的靶标；另一方面，EPSP合酶活性大小对生物体内莽草酸的积累有重要影响。6.1草甘膦及抗草甘膦EPSP合酶基因6.1.1草甘膦及其与EPSP合酶作用机制草甘膦作为一种
18、非选择性除草剂，在杀死杂草的同时，也会杀死农作物，进而限制了草甘膦的使用范围和时间，自1974年在美国注册登记以来，已成为当今世界上销售量最大且使用最广的农药品种，问世30多年来经久不衰。草甘膦与EPSP合酶的作用机制是：草甘膦与PEP在构造上非常类似，在莽草酸途径中草甘膦占据了EPSP合酶和PEP的连接位点，构成EPSP合酶S3Pglyphosate的复合物，使EPSP合酶催化烯醇式丙酮酸基团从PEP转化到S3P上构成EPSP的经过停止，竞争性抑制EPSP合酶的活性导致芳香族氨基酸和一些芳香化合物合成受阻，最终导致一些关键性代谢物和激素如酚类化合物、木质素、代谢失调，使生物体不能进行正常的氮
19、代谢而死亡，而且EPSP合酶进入叶绿体的经过也受草甘膦的抑制。6.1.2抗草甘膦EPSP合酶基因来源1983年，Comai等从鼠伤寒沙门菌中分离克隆出了抗草甘膦的突变基因aroA基因，此后很多研究者对抗草甘膦基因进行了深化广泛的研究。抗草甘膦的EPSP合酶基因主要来源于微生物和植物，而且研究者发现植物中的EPSP合酶比细菌中EPSP合酶对草甘膦的抗性大约低了两个数量级。表1为目前已获得的主要抗草甘膦EPSP合酶基因及其来源。目前获得抗草甘膦EPSP合酶编码基因的途径主要有两种：第1种是从天然抗草甘膦的物种或突变体中克隆分离出抗草甘膦基因或突变基因。在天然抗草甘膦基因中，土壤农杆菌CP4-EPS
20、P合酶基因是应用最广泛的抗草甘膦EPSP合酶基因，并构成商业化生产。除此之外，研究者从一些物种的突变体中克隆分离出抗草甘膦突变基因，如研究者克隆大豆、油菜、马铃薯及拟南芥抗草甘膦的EPSP合酶突变基因发现，大豆EPSP合酶基因编码的104Gly突变为Ala，油菜EPSP合酶基因编码的Gly96突变为Ala，马铃薯和拟南芥EPSP合酶第101位上Gly变为Ala。Shah等从挑选出的抗草甘膦矮牵牛MP4G细胞系中克隆出EPSP合酶的cDNA，将其cDNA导入矮牵牛叶片后，对草甘膦的抗性明显提高。Scott等发现牛筋草的EPSP合酶基因发生突变，第101位脯氨突变为色氨酸后，对草甘膦具有很低的敏感
21、度，表现出抗草甘膦。第2种是利用遗传学方法改造EPSP合酶编码基因，提高对草甘膦的抗性：定点突变能够减小酶与草甘膦的亲和力或提高酶与底物的亲和力，进而提高对草甘膦的抗性。Tian等利用定点突变使苹果的EPSP合酶基因编码的Thr101变为Ala，Ala187变为Thr，通过动力学分析证明两个氨基酸突变后提高了对草甘膦的抗性；Ming等使用易错倾向PCR随机突变技术使来源于大肠杆菌和沙门氏菌的aroA基因发生突变和重组，得到aroM1、aroM2、aroM3和aroM44种突变体，通过EPSP合酶活性的动力学分析表明，4种突变体的4个突变基因编码的EPSP合酶的活性比突变前提高了2-10倍，与烯
22、醇式丙酮酸的亲和性提高了2.5-19倍，与草甘膦的Ki值提高了0.4-8倍；Lebrun等使用定点突变，从玉米中克隆获得了抗草甘膦的CP4基因，而且先正达公司通过转基因技术开发出了耐草甘膦玉米品种GA21。研究者发现，通过遗传学方法改造EPSP合酶编码基因，固然提高了生物对草甘膦的抗性，但是也降低了EPSP合酶的催化活性，因而，目前改造成功并用于商业化生产的抗草甘膦转基因作物的基因几乎全部是CP4-EPSP合酶基因。6.2在抗菌素和抗寄生虫药物上的应用EPSP合酶能够作为抗菌素的靶标，如研究者通过试验删除肺炎链球菌和支气管炎博德特菌的EPSP合酶的基因后，发现二者的毒性减弱。在抗寄生虫药物方面
23、，研究者已经证明草甘膦能够抑制Toxoplasmgondii、Cryptosporidium以及Plasmodiumfalciparummalaria等顶复门寄生虫的生长。6.3EPSP合酶新型抑制剂草甘膦作为EPSP合酶的抑制剂是众所周知的，但随着EPSP合酶晶体与催化底物机理的深化研究，也推动了EPSP合酶新型抑制剂的研发。如研究者根据S3Pglyphosate、EPSP合酶的分子模型，设计并合成了与除草剂草甘膦具有类似抑制作用的化合物4，用等温低定量热法测定EPSP合酶与化合物4的连接常数值Kd为0.530.04mol/L，而EPSP合酶S3P+glyphosate的Kd值为0.150.
24、03mol/L，前者Kd值仅仅是后者的3.5倍，而且通过动力学、光谱学和微量热法证明了化合物4与EPSP合酶的结合位点和S3P与酶的结合位点是一样的，进而抑制EPSP合酶的催化活性。研究者报道了莽草酸衍生物、羟基丙二酸衍生物等都能够与EPSP合酶构成四面体过渡态，进而使EPSP合酶活性遭到抑制。目前，草甘膦仍然是作用于该靶标的有效抑制剂，还没有新的EPSP合酶抑制剂商业化应用，但随着除草剂草甘膦的使用越来越广，抗草甘膦杂草也越来越多，所以EPSP合酶新的抑制剂研究必将会成为热门74。6.4EPSP合酶对莽草酸代谢的影响莽草酸是生物体内很多物质合成代谢的中间体，也是人工化学合成很多生物碱、芳香氨
25、基酸与吲哚衍生物、手性药物如抗病毒药的原料。近年来，禽流感爆发此起彼伏，危害人类健康安全。莽草酸是合成目前在临床上唯逐一种有效抗禽流感药物磷酸奥斯米韦商品名为达菲，为瑞士Roche制药公司生产的关键原料，因而生物合成莽草酸的研究是目前的一个研究热门。EPSP合酶是莽草酸代谢下游的一个重要酶，研究表明，减弱或切断该酶基因的表达或抑制其酶活性也有利于莽草酸的合成积累。Kramer等报道，敲除EPSP合酶基因，使莽草酸和莽草酸-3-磷酸大量累积，后者去磷酸化后就获得目的产物。2011年公布的美国专利“草甘膦在微生物发酵法生产莽草酸中的使用就是利用草甘膦对EPSP合酶的抑制作用来提高微生物发酵生产莽草
26、酸产量。Bresnahan等研究报道，在给小麦施加非选择性除草剂草甘膦后，不仅有助于农作物的丰收，而且草甘膦还能够被吸收并转移到植物的活性生长区内，通过抑制EPSP合酶的合成，能够干扰莽草酸的正常代谢途径。在试验中观察到，在小麦乳熟期使用草甘膦会使其内部的莽草酸最多增加24倍，若在蜡熟期使用，其内部的莽草酸能增加3倍。7结语自EPSP合酶发现至今已有40多年，其理论与应用研究都获得了显著的成果。目前已发现并克隆出很多种EPSP合酶基因，十分在农业上的应用，随着很多耐草甘膦的EPSP合酶基因被克隆出来，有力的推动了耐草甘膦作物的发展。固然通过遗传学方法改造EPSP合酶编码基因，提高了生物对草甘膦
27、的抗性，但是也降低了EPSP合酶的催化活性，所以目前改造成功并用于商业化生产的抗草甘膦转基因作物的基因几乎全部是CP4-EPSP合酶基因，因而该领域有待进一步深化研究。另一方面，EPSP合酶可以以作为抗菌素和抗寄生虫药物的靶标。因而对EPSP合酶与草甘膦以及其它抑制剂的结合形式的研究，能够为设计出新的除草剂、抗寄生虫药物以及抗菌素提供有力的理论根据。此外，EPSP合酶也是促进生物体内莽草酸积累的重要调控位点，因而随着人们对EPSP合酶的全面深化研究，相信EPSP合酶基因会在医药卫生、农业生产等方面发挥更重要的作用。固然如今一些EPSP合酶的三维晶体构造已通过物理化学方法和X-射线衍射得到，但是
28、很多研究只报道了未与配体结合的EPSP合酶三级构造，所以不能完全确定酶的活性位点，但随着计算机技术的发展，可利用计算机模拟出EPSP合酶与底物的结合位点；另一方面通过计算机模拟，可为挑选出较高活性的EPSP合酶及抗草甘膦较强的EPSP合酶基因节省大量人力物力。本课题组首先利用分子对接软件进行反对接计算配体小分子化合物与不同生物的EPSP合酶结合自由能，同时根据计算结合自由能最低的结合形式分析底物、抑制剂草甘膦与EPSP合酶作用机理及其构效关系，提出EPSP合酶基因的改造方案，应用基因工程手段对目的生物EPSP合酶基因进行遗传改造，改造选育出有利于莽草酸积累的生物突变体或耐草甘膦作物；另一方面根据底物、抑制剂草甘膦与EPSP合酶作用机理及其构效关系，可以提出抑制剂改造方案，合成新的抑制剂备选化合物，通过试验验证最终挑选获得更有效的除草剂、抗菌素或抗寄生虫药物。