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1、多种雌激素残留的质谱分析建立了同时测定7种雌激素残留的液相色谱串联质谱法在最优条件下，待测物呈现良好的线性关系，相关系数均大于09957，检测限介于050005000ng/mL范围鱼肉组织经C18小柱净化浓缩，40mL乙腈水(体积比595，%)淋洗，20mL乙腈水(体积比955，%)洗脱三类鱼肉样品中(鮦鱼、龙胆鱼、多宝鱼)均检出双酚A和己二烯雌酚，部分样品中检出雌二醇和雌酮，加标回收率为8570%1209%方法快速、准确，适用于水产品中雌激素多残留的高效测定关键词:雌激素;固相萃取;液相色谱;串联质谱;水产品雌激素是一类常见的内分泌干扰物，会扰乱机体内分泌物的正常生成、转化、代谢和结合，造成
2、生物体免疫、生殖功能异常12近年来，避孕药和畜牧养殖用药使用量激增，在湖泊、河流、污水中均存在雌激素富集的现象，导致鱼类出现严重性畸形3对人类而言，雌激素通过食物链转移，进入人体可诱发儿童性早熟，对成人生育功能也有影响，尤其对女性影响最为明显，易造成流产、婴儿出生缺陷等问题，甚至诱发卵巢癌、乳腺癌等疾病45因而，雌激素对环境、生态和人类的影响备受关注，有必要建立灵敏、科学的方法分析雌激素目前，雌激素多残留检测分析方法已有综述67，主要包括气相色谱8、气相色谱质谱联用法910、液相色谱法1112、液相色谱质谱联用1316等其中，液相色谱串联质谱(HPLCMS/MS)以选择性强、灵敏度高的特点，应
3、用最广四级杆飞行时间质谱(QTOFMS)灵敏、分辨率高、特异性强，基于碰撞诱导解析和二级质谱功能，提供化合物的构造断裂原理，在雌激素等药物残留检测中具有良好的应用前景1试验部分11仪器与试剂1200系列液相色谱6520型四级杆飞行时间串联质谱仪(Agilent，USA);MilliQ超纯水系统(Milipore，USA);701800固相萃取装置(JTBaker公司)雌三醇(E3)、双酚A(BPA)、雌二醇(E2)、2，4二氯苯酚(2，4dcp)、己二烯雌酚(DE)购自Sigmaaldrich公司，炔雌醇(EE)、雌酮(E1)购自德国DrEhrenstorferGmbh公司乙腈为色谱纯(Sig
4、maaldrich公司)，乙酸铵购自天津市福晨化学试剂厂，试验用水为超纯水所有试剂使用前过滤12溶液配制及工作曲线绘制标准溶液:准确称取适量标准品，乙醇溶解，配制成1000g/mL储备液，4储存乙酸铵溶液:称取077g乙酸铵，定容至1000mL，稀释成50、10mmol/L溶液，用于后续试验工作曲线绘制:混合标准母液用超纯水逐级稀释，获得一系列混标工作溶液在最优条件下测定，根据峰面积与相应浓度的关系绘制工作曲线13液相色谱质谱条件色谱柱AgilentZorbaxSBC18(5m，46150mm);流动相为H2O(A)乙腈(B)二元体系;梯度洗脱;流速04mL/min;进样量8L;柱温35质谱选
5、择ESI()和多反响监测形式;枯燥气温度350、流速10L/min;雾化气压力0276MPa;毛细管电压3500V;碎裂电压140V;2GHz动态拓展采集形式;m/z100310试验所用气体为氮气(纯度999%)，碰撞气为高纯氮气(纯度99999%)14样品处理样品提取:鮦鱼、龙胆鱼、多宝鱼购自福州马尾水产品批发市场鱼类去头、鳞、骨及内脏，取鱼肉组织，液氮中研磨成鱼粉称取050g鱼粉，参加50mL乙腈，超声提取10min，10000r/min下离心10min，取上清液残渣再用20mL乙腈重复提取，合并两次上清液提取液用正己烷脱脂，每次用量30mL，重复操作二次，弃去正己烷，氮气吹干，用20mL
6、H2O溶解待用固相萃取(SPE):BondElutC18小柱(200mg/3mL，Agilent公司)用30mL甲醇活化、30mL水平衡，提取液过柱，40mL乙腈水(体积比595，%)淋洗、20mL乙腈水(体积比955，%)洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩，H2O定容至10mL，过滤后供HPLCMS分析2结果与讨论21色谱流动相选择选定ZorbaxSBC18色谱柱(5m，15046mm)，考察乙腈水、乙腈10mmol/L乙酸铵及乙腈50mmol/L乙酸铵作为流动相的效果，结果如图1(a)所示试验结果表明，乙酸铵浓度增大，雌激素峰面积总体呈下降趋势故采用乙腈H2O为流动相，此时色谱峰响应高、分离效果理
7、想在分离复杂混合物时，梯度洗脱能提高分析效率、改善分离度尝试了多种梯度方案对混合物分离的影响结果发现，最优的梯度洗脱程序为:040min，维持65%B;4041min，65%97%B;4180min，维持97%B;8085min，97%65%B，流速为04mL/min在单次分析结束后，充分冲洗和平衡色谱柱22MS条件的优化7种雌激素的化学构造式如图2所示，其构造中含有不同数量的羟基或氯原子，首选ESI()检测为保证母离子良好的传输效率，优化了质谱碎裂电压的影响，如图1(b)所示当碎裂电压介于140150V之间，大部分物质的响应值基本恒定，故选取碎裂电压为140V其他质谱参数的选择是为了改善喷雾
8、效果和电离状况，提高方法的灵敏度经优化，确定枯燥气温度350，枯燥气流速10L/min最优条件下，待测物在8min内实现分离，且构成很强的MH母离子峰和明显的同位素峰(如图3所示)23前处理方法探索比照了两种C18小柱的萃取效果结果发现，ProElutC18小柱对E3和BPA的回收率不理想(低于50%)提取液经BondElutC18小柱过柱，采用5%、10%、20%的乙腈水溶液淋洗乙腈含量越高，淋洗液的洗脱能力越强5%乙腈水淋洗时，后续检测杂质稍多，但利用质谱提取离子功能，目的物测定不受影响且回收率较高考察乙腈质量分数在80%100%的洗脱效果当乙腈质量分数低于90%时，后续浓缩步骤耗时长、回
9、收率不高;乙腈质量分数为95%时的洗脱效果与100%乙腈接近，因而选择95%乙腈将目的物洗脱优化了洗脱液体积(1030mL)，发现用量为20mL时，目的物回收效果较好因而，BondElutC18小柱以40mL5%乙腈水淋洗，20mL95%乙腈洗脱相较于液液萃取，SPE法操作简便、节省有机溶剂24二级质谱解析利用串联质谱对分析物进行构造分析(如图4所示)E2、E3、EE和E14种组分具有一样母核，构成共同的碎片离子峰m/z1450637(或1430491)、1830798，上述物质的断裂原理与文献1718相符BPA苯环侧链上两个甲基空间位阻大，揣测丢失CH3、C6H6O、C3H4等自由基碎片2，
10、4dcp对应的碎片离子m/z1249776、890034为连续丢失Cl所得DE是苯二烯类化合物，分别构成MHCH3、MHC3H6、C6H5O等碎片后3种物质的多级质谱断裂途径鲜见报道(如图5所示)25方法验证准确配制7种雌激素的系列标准混合液，考察线性关系，以3倍信噪比为检测限，结果如表1所列方法的检测限为050005000ng/mL，相关系数介于0995709999范围内以200ng/mL标准混合液(BPA40ng/mL，EE400ng/mL，其余组分为200ng/mL)进行精细度试验，连续5天进样，日间SD小于9074%，表明方法稳定且重现，合适于7种雌激素的定量分析26鱼肉样品分析鱼肉样
11、品中雌激素的计算公式为:Cx=CiV/m，其中，Ci为各化合物质量浓度(由标准曲线计算，ng/mL)，V为样品处理最后定容的溶液体积(mL)，m为鱼粉质量(g)试验发现，鱼肉样品基质复杂，虽经SPE净化，在质谱总离子流图中干扰峰仍较多利用QTOF质谱的提取离子功能结合保留时间、准确质量数等信息，3种鱼肉中均检出BPA和DE，部分样品检出E2和E1残留(如表2所列)向龙胆鱼样品添加两个不同质量浓度的目的物，每个水平测定3份样，计算回收率(如表3所列)由表3可得，目的物回收率大于8570%，SD为08370%3568%，表明方法可靠，知足分析检测的要求建立了固相萃取液相色谱串联质谱快速测定7种雌激素残留的方法结合QTOFMS/MS定性准确、构造信息丰富的特点，揣测了部分雌激素的裂解途径此研究能为水产品中激素类药物残留的快速鉴定提供分析手段，也有助于了解雌激素残留分布的规律，为保证食品安全提供方法借鉴