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1、Eca-109细胞生物学功能影响1方法1.1干扰YAP1慢病毒转染Eca-109细胞将Eca-109细胞分为三组:转染组(YAP1干扰慢病毒转染Eca-109细胞)、空病毒转染组(空病毒转染Eca-109细胞)和空白对照组(未进行处理的Eca-109细胞)。在培养瓶中培养Eca-109细胞,待细胞状态良好、处于对数生长期时,以每孔1105细胞数接种于6孔板,培养液2mL,于37C、5%CO2的培养箱中培养8h。弃去原培养液,参加1mL新鲜培养液,病毒稀释后以MOI值40的病毒数量参加到6孔板中,混匀,继续培养12h后弃去含病毒的培养液,参加1mL新鲜培养液继续培养,常规换液,培养96h。荧光显
2、微镜下观察荧光表达情况,转染效率大于90%视为转染成功,转至培养瓶继续培养。1.2qPCR检测各组细胞YAP1mRNA表达情况YAP1引物由上海生工生物工程有限公司构建,GAPDH为内参(表2)。取一定量的细胞用0.25%胰酶消化,离心收集细胞,加Trizol裂解提取总RNA,RNA浓度测定合格后,用逆转录试剂盒逆转录成cDNA,以GAPDH为内参,进行qPCR。扩增程序为:95C30s,95C5s,60C30s,40个循环,每个样品设置3个重复。1.3Westernblot检测YAP1和P53蛋白表达将转染组、空病毒转染组、空白对照组细胞进行消化离心后以预冷的PBS清洗细胞2次,转至EP管离
3、心弃上清液,参加适量蛋白裂解液和1%体积的蛋白酶抑制剂,置于冰上裂解30min,然后于4C、12000r/min离心15min,得到总蛋白。BCA法测蛋白浓度,取50g,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至PVDF膜上,50g/L脱脂牛奶封闭2h后参加一定比例稀释的一抗,4C孵育过夜后TBST室温摇床洗膜5min5,参加相应稀释的二抗,37C孵育1h,TBST室温摇床洗膜5min5,参加ECL发光试剂后凝胶成像显影。以-actin为内参,对条带用QuatityOne软件进行统计分析。1.4流式细胞仪检测细胞周期和凋亡培养细胞至铺板70%80%,换无血清培养基培养24h,换正常培养液培养24h,
4、消化、离心收集细胞,预冷PBS洗2次后参加预冷70%乙醇固定,4C固定过夜。离心弃去固定液后参加RNase和PI,避光染色30min,流式细胞仪检测周期分布。实验重复3次。消化离心收集各组细胞约1106,PBS洗2次加500LBindingbuffer重悬细胞,参加2LAnnexinV-FITC混匀,参加5L碘化丙啶,混匀。避光、室温反响5min,流式细胞仪检测凋亡率。实验重复3次。1.5CCK8法检测细胞增殖能力将对数生长期的Eca-109细胞按1000/孔的量接种于96孔板中,分三组(空白对照组、空病毒转染组、转染组),每组设3个复孔,每孔加100L培养液,置于37C、5%CO2培养箱内培
5、养24h。分别进行空病毒和慢病毒转染操作,转染24h后开场检测,在固定时间向待测孔参加10LCCK8溶液,37C避光反响1h后用酶标仪测定吸光度(D)值。实验重复3次。1.6统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料以均数标准差(x_s)表示,两组均数比拟采用t检验;多组间单因素分析采用One-WayANOVA检验;P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1慢病毒转染获得稳定干扰YAP1的Eca-109细胞株转染操作96h后于荧光显微镜下观察荧光情况,空载体组和转染组荧光均较强,经计算,转染效率均在90%以上,转入培养瓶中培养,得到稳定株(图1)。2.2qPCR检测转染前后YAP
6、1mRNA的表达情况qPCR结果显示,转染组YAP1mRNA表达量明显低于空白对照组和空病毒转染组(P0.05);而空白对照组和空病毒转染组YAP1mRNA表达量差异无统计学意义(P0.05,图2和表3)。2.3Westernblot检测各组细胞YAP1和P53蛋白的表达情况Westernblot结果显示,转染组YAP1的蛋白表达量低于空白对照组和空病毒转染组(P0.05);转染组P53蛋白表达量高于空白对照组和空病毒转染组(P0.05);而空白对照组和空病毒转染组YAP1以及P53蛋白表达量差异无统计学意义(P0.05,表3和图3)。2.4干扰YAP1基因对Eca-109细胞增殖的影响CCK
7、8实验结果显示,在转染前2d,转染组、空病毒转染组和空白对照组在每个时间点的D值无明显差异(P0.05);转染后第4d开场,转染组D值低于空白对照组和空病毒转染组(P0.05),而空病毒转染组和空白对照组之间的D值仍无明显差异(P0.05,图4)。2.5干扰YAP1基因对Eca-109细胞凋亡的影响流式细胞仪对三组细胞进行检测,结果显示,转染组早期凋亡率分别高于空白对照组和空病毒转染组(P0.05),差距有统计学意义,而空白对照组和空病毒转染组早期凋亡率无明显差异(P0.05,图5和表4)。2.6干扰YAP1基因对Eca-109细胞细胞周期的影响流式细胞仪对三组细胞进行细胞周期检测。结果显示,
8、转染组G1期细胞比例高于空白对照组和空病毒转染组(P0.05),S期细胞比例低于空白对照组和空病毒转染组(P0.05),三组细胞间G2期细胞比例均无差异(P0.05,图6和表4)。3讨论我国是食管癌高发区,其发病率和病死率均居世界之首。HIPPO通路对哺乳动物细胞的增殖和凋亡有重要调节作用。YAP作为HIPPO通路中的重要元件,研究证实,YAP在多种肿瘤中高表达,如乳腺癌、肺癌和前列腺癌。目前以为,YAP为原癌基因,其磷酸化可促进细胞凋亡,其去磷酸化可促使其进入细胞核与核内TEAD结合,促进细胞增殖。然而,Aylon等12发现,YAP可通过ASSP1影响p53基因,进而影响细胞凋亡。自1998
9、年AndrewFire等初次发现RNA干扰现象以来,RNA干扰成为研究基因的重要手段之一。近来,Xue等学者通过RNAi技术干扰食管癌Eca-109细胞HAT1(histoneacetyltrans-ferase1)基因,发现HAT1对于食管癌Eca-109细胞增殖具有重要作用。目前关于YAP在食管癌中的作用,国内外相关报道均较少。诱导肿瘤细胞凋亡一直是肿瘤治疗的重要研究方向。本研究利用慢病毒转染食管癌Eca-109细胞,使用qPCR和蛋白印迹法验证YAP1基因的表达被成功抑制。后期本研究通过qPCR、蛋白印迹、CCK8实验、流式细胞仪测周期和凋亡等多种方法验证了干扰YAP1具有抑制Eca-109细胞增殖、促进其凋亡的作用。同时,通过转染前后Eca-109细胞内p53基因的表达量分析,证明YAP1不仅仅作为HIPPO通路的重要组成元件,同时可以以通过p53基因途径诱导细胞进入经典凋亡通路,促进食管癌Eca-109细胞凋亡。这些为食管癌的基因靶向治疗奠定了一定的基础。YAP1在食管癌的发生、发展中可能起着重要作用。固然通过我们以上的研究证明了部分机制,然而关于YAP1与细胞凋亡发生的机制以及YAP1与其他通路之间的关系可能仍非常复杂,这有待于进一步研究。全面深化地研究YAP1的作用机制可能为食管癌的早期诊断和治疗提供新的策略和靶点。