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1、褪黑素对放疗后大鼠卵巢的保护作用（医学研究生学报）2014年第六期1材料与方法11标本采集各组大鼠于射线照射后每日取阴道分泌物涂片光镜观察动情周期，照射后2周于动情间期处死大鼠，主动脉弓取血。取双侧卵巢，右侧卵巢4%多聚甲醛固定，左侧卵巢存于液氮罐。12激素测定方法采用ELISA法测定大鼠血清中的E2、FSH。大鼠主动脉弓采血，分离血清，按AMEKO试剂公司ELISA试剂盒操作讲明进行。13组织形态学观察及卵泡计数右侧卵巢石蜡包埋，取最大横断面切片后HE染色，光镜下计数具有正常卵泡构造的卵泡数3，分别计数各组大鼠的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡。14caspase3测定采用分光光度法测
2、定大鼠左侧卵巢组织caspase3的活性。由于caspase3可催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色物质pNA，因而能够通过测定pNA在405nm的吸光度来测定caspase3的活性。试剂盒购置碧云天生物科技公司，按试剂盒操作讲明进行。18统计学分析所有指标采用SPSS180软件进行统计学分析。计量数据检测结果以均数标准差(xs)表示;多组均数间的比拟用单因素方差分析(One-WayANOVA);组间两两比拟，知足方差齐性时采用LSD法检验;若方差不齐，两两比拟采用基于t检验的保守TambanesT2检验，以P005为差异有统计学意义。2结果21大鼠动情周期变化各组大鼠干涉前均表现为正常动情
3、周期，4d为1周期。T组和T+MT(25mg/kg)组接受照射24h后仅出现动情后期或动情间期。T+MT(50mg/kg)组、T+MT(100mg/kg)组大鼠照射24h后仅出现动情后期或动情间期，一周后恢复正常动情周期。对照组动情周期无改变。22大鼠血E2和FSH水平变化E2水平变化:射线照射后，T组E2水平显著低于对照组(P005);其中T+MT(25mg/kg)组与T组比拟差异无统计学意义(P005);T+MT(50mg/kg)组与T+MT(100mg/kg)组较T组E2水平显著升高(P005)，且T+MT(100mg/kg)组E2水平显著高于T+MT(50mg/kg)组(P005)，作
4、用呈剂量依靠性。FSH水平变化:射线照射后，T组FSH水平显著高于对照组(P005);其中T+MT(25mg/kg)组与T组比拟差异无统计学意义(P005);T+MT(50mg/kg)组与T+MT(100mg/kg)组较T组FSH水平显著降低(P005)，T+MT(100mg/kg)组FSH水平与T+MT(50mg/kg)组比拟差异无统计学意义(P005)。见表1。23大鼠卵泡数量变化射线照射后，T组卵泡总数显著低于对照组(P005);其中T+MT(25mg/kg)组与T组比拟差异无统计学意义(P005);T+MT(50mg/kg)组与T+MT(100mg/kg)组较T组卵泡总数显著升高(P0
5、05)，且T+MT(100mg/kg)组卵泡总数显著高于T+MT(50mg/kg)组(P005)，作用呈剂量依靠性。见表2。24大鼠卵巢组织光镜下改变对照组卵巢构造明晰，卵巢中可见原始卵泡，各级发育中的卵泡及成熟卵泡;T组卵巢可见其皮质增厚，构造混乱，间质纤维化，皮质中原始卵泡数量稀疏，各级生长卵泡与成熟卵泡数目锐减，见大量闭锁卵泡及多个大的陈旧样黄体组织;T+MT(100mg/kg)组卵巢构造明晰，卵巢中可见原始卵泡，各级发育中的卵泡及成熟卵泡，并可见少量闭锁卵泡及黄体样物质。见图1。25大鼠卵巢组织capase3活性变化对照组大鼠caspase3活性极低，射线照射后，T组大鼠caspase
6、3活性较对照组显著升高(P005);其中T+MT(25mg/kg)组与T组比拟差异无统计学意义异(P005);T+MT(50mg/kg)组与T+MT(100mg/kg)组较T组caspase3活性显著降低(P005)，且T+MT(100mg/kg)组caspase3活性显著低于T+MT(50mg/kg)组(P005)，作用呈剂量依靠性。见表3。3讨论卵巢是女性生殖系统中对辐射较为敏感的区域，随着照射剂量的增加，卵巢功能损伤也愈加严重4。卵巢功能损伤是接受放疗或者化疗治疗的患者一个主要的远期并发症，大剂量、长时间的化疗将会损伤各年龄段患者的卵巢功能，导致闭经，生殖能力下降或丧失5;因而在提高患者
7、的生存率的同时，保护卵巢功能减轻或避免放疗所致的卵巢功能损伤成为当下研究的热门。建立有效的放疗模型对于讨论放疗致卵巢功能损伤的机制及其预防和治疗措施具有重要意义。研究人员通常根据大鼠的动情周期的规律性来评估其卵巢功能6。本研究中，对于放疗组大鼠，在射线照射后，不再出现动情周期，而光镜下其卵巢组织形态为卵巢皮质增厚，构造混乱，间质纤维化，皮质中原始卵泡数量稀疏，各级生长卵泡成熟卵泡数目锐减，见大量闭锁卵泡，卵巢中可见多个大的陈旧样黄体组织，可见其卵巢功能明显下降，这与该组大鼠动情周期的检测结果相符合。有实验表明卵巢中卵泡总数是反响卵巢功能的重要指标7。在本实验中，放疗后大鼠卵巢组织中卵泡总数明显
8、减少;放疗后卵巢组织各级卵泡凋亡闭锁，卵泡随之产生的E2减少，血液中E2水平的降低将反应性地刺激下丘脑垂体性腺轴进而增加FSH的分泌;T组大鼠FSH升高，E2降低，卵泡总数明显减少，模拟了临床放疗后育龄女性体内激素水安然平静卵巢储备的变化，同时能够表明放疗可直接导致卵巢功能的下降。因而，动情周期减少，E2水平降低，FSH水平升高，以及卵泡总数减少是评价放疗致大鼠卵巢功能损伤模型成功构建的关键指标。放疗产生的电离辐射与水分子互相作用可构成高度活性的羟自由基-(OH)。相关研究表明60%70%的组织损伤和细胞DNA损伤是电离辐射产生的-OH所造成的，有报道称随着照射剂量的增加卵泡凋亡的比例增加8。
9、MT是松果体分泌的一种神经内分泌激素，研究表明MT是一种非酶类抗氧化物质，其除了众所周知的调节昼夜节律功能外，还能去除-OH和不同的活性氧簇，是高效的内源性抗氧化剂9，MT主要通过去除-OH发挥抗辐射作用。当MT与-OH互相作用时，MT构成过渡性的吲哚基，其毒性很低10。使用MT能够降低血浆和红细胞内的丙二醛(malondialdehyde，MDA)的水平，MDA是全身照射后的氧化损伤产物。MT还可提升超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平，因而MT能够通过上调抗氧化物酶来对抗电离辐射11。此外MT只要在射线照射之前给药才能起到保护作用，照射后给药则不具备保护作用;这讲明在接受照射时，MT必须
10、进入细胞内才能发挥其抗辐射作用12。Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase)，是一组存在于细胞质中直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶13。其主要介入线粒体凋亡途径，上调的促凋亡蛋白Bcl-2家族(如Bax，Bak)或下调的抑凋亡蛋白Bcl-2、BclxL均能够诱导线粒体凋亡途径的发生15。在凋亡发生时，促凋亡家族成员被激活并且转移到线粒体发生寡聚体化。进而导致线粒体膜通道孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpores，MPTP)的开放16。通过MPTP一些促凋亡因子将会被释放进
11、入细胞质中导致凋亡的发生。线粒体内的相关蛋白的释放在线粒体介导的细胞凋亡中发挥着重要作用，其中细胞色素C进入细胞质，结合促凋亡蛋白激酶激活因子1构成复合物，进一步导致caspase级联反响的激活，最终导致组织细胞发生凋亡。大量的事实证实，capase3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，处于级联反响的核心位置，被称为死亡蛋白酶1718。近期的研究发现capase3和卵泡闭锁关系密切1920，本实验中T组capase3活性明显高于其他组，能够揣测射线照射是通过激活caspase3来实现卵泡的凋亡闭锁和卵巢功能的减退。由于caspase3在凋亡途径中扮演着重要的角色，要检测MT能否抑制电离辐射诱导的
12、卵巢组织凋亡，caspase3无疑是主要指标之一。MT对caspase3活化的抑制作用在疟疾诱导的小鼠肝损伤模型中已见报道，疟疾感染小鼠后，通过激活caspase3来促进肝细胞凋亡，MT能够明显抑制caspase3的活性，进而起到了保护小鼠肝功能的作用21。本实验在射线照射前预先腹腔注射50mg/kg、100mg/kgMT，可剂量依靠性地减轻射线对卵巢功能的损伤，同时伴有卵巢组织capase3活性的平行下降，提示MT对卵巢功能的保护作用可能与其抑制caspase3的过度活化有关。综上所述，本研究表明capase3信号转导途径介入了射线诱导的卵巢功能损伤的发生;MT可有效减轻射线对卵巢功能的损伤作用，其分子机制可能与其抑制射线诱导的caspase3的过度活化有关，这种抑制作用能否经过线粒体途径发生仍需进一步的研究。