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1、会计学1抗体抗体(kngt)的制备与纯化的制备与纯化第一页，共37页。 第一节 常规抗血清的制备(zhbi)方法一、动物的免疫(miny)二、抗血清的采集第1页/共37页第二页，共37页。1、免疫动物的选择2、抗原接种(jizhng)3、佐剂的应用动物动物(dngw)的免疫的免疫第2页/共37页第三页，共37页。免疫免疫(miny)动物的选择动物的选择种属与品系(pn x)经济性“R”型与“H”型经验性适配第3页/共37页第四页，共37页。抗原抗原(kngyun)接种接种剂量：注射途径(tjng)：间隔与免疫时间：接种次数：第4页/共37页第五页，共37页。佐剂的概念佐剂的概念(ginin)与
2、种类与种类概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高(t go)抗原的免疫原 性的物质。种类：非免疫原性物质 免疫原性物质第5页/共37页第六页，共37页。佐剂的作用佐剂的作用(zuyng)机理机理延长抗原的作用时间增强(zngqing)吞噬作用刺激抗原提呈促进细胞因子分泌诱导淋巴细胞分裂、增殖影响T细胞“极化”第6页/共37页第七页，共37页。1、采集(cij)方法2、血清的分离与灭活抗血清的采集抗血清的采集(cij)第7页/共37页第八页，共37页。采集采集(cij)方法方法一次性采集(cij)多次性采集(cij)第8页/共37页第九页，共37页。抗血清的分离抗血清的分离(fnl)与灭活
3、与灭活血清析出(xch)的温度血清的灭活第9页/共37页第十页，共37页。 第二节 单克隆抗体(kngt)的制备方法一、单克隆抗体与杂交瘤技术二、单克隆抗体的制备(zhbi)过程三、单克隆抗体的特性第10页/共37页第十一页，共37页。单克隆抗体单克隆抗体(kngt)与杂交瘤技术与杂交瘤技术1、单克隆抗体(kngt)2、杂交瘤技术第11页/共37页第十二页，共37页。表位A表位B表位C抗原(kngyun)克隆(k ln)A克隆(k ln)B克隆C多克隆抗体单克隆抗体第12页/共37页第十三页，共37页。单克隆抗体单克隆抗体(kngt) 由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆(k ln)所
4、产生的同源抗体。第13页/共37页第十四页，共37页。杂交瘤技术杂交瘤技术(jsh) 通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能(gngnng)和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。第14页/共37页第十五页，共37页。单克隆抗体单克隆抗体(kngt)制备过程制备过程1、致敏淋巴细胞的准备(zhnbi)2、骨髓瘤细胞的准备(zhnbi)3、细胞融合4、选择性培养5、抗体分泌细胞的筛选6、克隆化过程7、单克隆抗体的制取第15页/共37页第十六页，共37页。抗原(kngyun)致敏淋巴细胞骨髓瘤 细胞(xbo)融合(rngh)选择性
5、培养抗体分泌细胞筛选克隆化单抗制取单抗纯化单抗鉴定第16页/共37页第十七页，共37页。致敏淋巴细胞的准备致敏淋巴细胞的准备(zhnbi)动物选择：品系、年龄、性别、健康状态(zhungti)抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定收集时间：末次接种后72h第17页/共37页第十八页，共37页。骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(xbo)的准备的准备细胞株处于良好的生长状态(zhungti)细胞株保持HGPRT缺陷状态(zhungti)第18页/共37页第十九页，共37页。细胞融合细胞融合方式(fngsh)：物理、化学、生物PEG融合要点：（见图）第19
6、页/共37页第二十页，共37页。致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞(xbo)离心(lxn) 1000rpm 10min50%PEG 1ml培养液 10ml离心(lxn) 1000rpm 7min37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内第20页/共37页第二十一页，共37页。选择性培养选择性培养(piyng)随机融合(rngh)后的细胞类型HAT选择培养原理第21页/共37页第二十二页，共37页。随机融合后的细胞随机融合后的细胞(xbo)类型类型细胞组合 HGPRT 生长状态淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期(dun q)生长骨髓
7、瘤 + 骨髓瘤 不能生长未融合淋巴细胞 + 短期(dun q)生长未融合骨髓瘤 不能生长第22页/共37页第二十三页，共37页。HAT选择选择(xunz)培养原理培养原理核苷酸从头合成途径(tjng)（de novo synthesis）核苷酸补救(bji)合成途径（salvage synthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）第23页/共37页第二十四页，共37页。抗体分泌细胞抗体分泌细胞(xbo)的筛选的筛选对筛选方法(fngf)的要求： 多大量样品一次检测 快迅速取得检测结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法(fngf)灵敏度高常用筛选方法(fngf)
8、： ELISA、RIA、CDC、IFA等第24页/共37页第二十五页，共37页。克隆克隆(k ln)化过程化过程概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释(xsh)法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞第25页/共37页第二十六页，共37页。有限有限(yuxin)稀释法稀释法计数(j sh)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第26页/共37页第二十七页，共37页。单克隆抗体单克隆抗体(kngt)的制取的制取制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对(zhnd
9、u)同一决定簇第27页/共37页第二十八页，共37页。多抗与单抗制剂多抗与单抗制剂(zhj)的比较的比较 多抗 单抗 单抗 （血清） （腹水） （培养上清）特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025无关(wgun)Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性 + +特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇稳定性 较好 略差 略差重复性 差 好 好第28页/共37页第二十九页，共37页。单克隆抗体单克隆抗体(kngt)的特性的特性1、理化性状高度均一2、抗原结合(jih)性高度特异3、生物活性高度单一第29页/共37页第三十页，共37页
10、。 第三节 抗体的纯化(chn hu)与鉴定一、抗体纯化的目的与方法(fngf)二、纯化抗体的鉴定与保存第30页/共37页第三十一页，共37页。抗体抗体(kngt)纯化的目的纯化的目的1、去除杂蛋白2、去除杂抗体3、去除非(chfi)同类抗体第31页/共37页第三十二页，共37页。抗体纯化抗体纯化(chn hu)的方法的方法1、盐析、层析技术2、抗原(kngyun)吸附第32页/共37页第三十三页，共37页。纯化抗体纯化抗体(kngt)的鉴定的鉴定1、多克隆(k ln)抗体的鉴定2、单克隆(k ln)抗体的鉴定第33页/共37页第三十四页，共37页。纯化纯化(chn hu)抗体的保存抗体的保存1、4。C保存(bocn)2、 20。C保存(bocn)3、冷冻干燥保存(bocn)第34页/共37页第三十五页，共37页。本章本章(bn zhn)小小结结1、多克隆抗体的制备2、杂交瘤技术的原理(yunl)与应用3、单克隆抗体的概念与特点4、抗体的纯化与鉴定第35页/共37页第三十六页，共37页。思考题思考题1、比较多克隆抗体(kngt)与单克隆抗体(kngt)的特点 并考虑其在应用上的差异2、以杂交瘤技术制备单克隆抗体(kngt)的主要 技术步骤有哪些？3、如何对获取的抗体(kngt)进行鉴定？第36页/共37页第三十七页，共37页。