检验步骤标准版.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流检验步骤标准版.精品文档.1、鸡新城疫低毒力活疫苗（Lasota株）1、安全检验检验步骤：27日龄SPF鸡20只10只滴鼻免疫0.05ml（含10羽份）；10只不接种对照同条件分别饲养10日，因无不良反应（如有非特异性死亡，免疫对照组均不得超过1只）疫苗稀释：500羽/瓶加2.5ml生理盐水即可（200羽/ml即20羽/0.1ml即10羽/0.05ml）2、效力检验检验步骤：按瓶签注明羽份（500羽/瓶），用灭菌生理盐水将疫苗稀释至1羽/0.1ml再进行10倍系列稀释取3个适宜稀释度分别尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚5枚（共15枚）每胚

2、0.1 ml37继续孵育120h48h前弃去；48120h内死亡鸡胚收获尿囊液（同一稀释度等量混合）分别测定红细胞凝集价；120h活胚逐个测红细胞凝集价（微量法不低于1:128者判为感染）计算EID50,每羽份病毒含量应106.0 EID50.疫苗稀释：500羽/瓶加ml生理盐水（100羽/ml）10倍稀释（10羽/ml即1羽/0.1ml）再进行10倍系列稀释（一般取10-5、10-6、10-7）3、鉴别检验检验步骤：将疫苗用生理盐水稀释至105.0 EID50/0.1ml与等量抗鸡新城疫特异性血清混合室温作用60min尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1 ml37继续孵育1

3、20h24120h内应不引起特异性死亡，且至少存活8枚；每枚鸡胚红细胞凝试验应为阴性。疫苗稀释：通过效力检验计算毒价，例如病毒含量为108.6 EID50/0.1ml要稀释至105.0 EID50/0.1ml，稀释103.6倍。 2、鸡新城疫中等毒力活疫苗（I系）1、安全检验检验步骤：28月龄健康易感鸡4只每只肌肉注射0.2ml？（含10个使用剂量）的疫苗观察1014日，允许有不良反应，但须在14日内恢复，疫苗判为合格。如有1只鸡出现腿麻痹，不能恢复时，允许用8只鸡重检一次，重检结果如有1只鸡出现上述同样反应，疫苗判为不合格。疫苗稀释：500羽/瓶加ml生理盐水（100羽/ml即20羽/0.2

4、ml）再2倍稀释（10羽/0.2ml）2、效力检验检验步骤：按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水将疫苗稀释至1羽/0.1ml再进行10倍系列稀释取3个适宜稀释度（如10-4、10-5、10-6）分别尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚5枚（共15枚）每胚0.1 ml37继续孵育2472h记录鸡胚死亡情况，死亡胎儿应有明显病痕。同一稀释度的死胚胚液等量混合，测定血凝价，微量法不低于（1:64）（1:512）判为感染计算EID50，每羽份病毒含量应105.0 EID50。疫苗稀释：500羽/瓶加ml生理盐水（100羽/ml）10倍稀释（10羽/ml即1羽/0.1ml）再进行10倍系列稀释（一般取10-5

5、、10-6、10-7）3、鉴别检验检验步骤：用灭菌生理盐水将疫苗稀释至103.0 EL D50？50/0.1ml与等量抗鸡新城疫特异性血清混合室温作用60min尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1 ml37继续孵育120h24120h内应不引起特异性死亡，且至少健活8枚；每枚鸡胚红细胞凝试验应为阴性。 疫苗稀释：通过效力检验计算毒价，3、鸡痘活疫苗1、安全检验检验步骤：114日龄SPF鸡10只各肌肉注射0.2 ml（含10羽份）观察10日应全部健活疫苗稀释：500羽/瓶加ml生理盐水（100羽/ml）2倍稀释（50羽/ml即10羽/0.2ml）2、效力检验检验步骤：按瓶签注明

6、羽份，将疫苗用生理盐水稀释至1羽/0.2ml再进行10倍系列稀释取3个适宜稀释度经绒毛尿囊膜（CAM）分别接种1112日龄SPF鸡胚5枚（共15枚）每胚0.2 ml37继续孵育96120h鸡胚绒毛尿囊膜水肿增厚或出现豆斑判为感染计算EID50,每羽份病毒含量应103.0 EID50.疫苗稀释：500羽/瓶加ml生理盐水（100羽/ml）10倍稀释（10羽/ml即1羽/0.1ml）2倍稀释（5羽/ml即1羽/0.2ml）再进行10倍系列稀释（一般取10-2、10-3、10-4）NDV鸡新城疫病毒 FPV鸡痘病毒 IBV鸡传染性支气管炎病毒 IBDV鸡传染性法氏囊病毒 ILT鸡传染性喉气管炎病毒

7、4、猪多杀性巴士杆菌病活疫苗1、安全检验（1）小鼠检验：检验步骤：1822克小白鼠5只皮下注射0.2 ml（含1/ 30头份）观察10日应全部健活疫苗稀释：50头份/瓶加ml生理盐水（10头份/ml）倍稀释（1头份/ml）6倍稀释（1/6头份/ml即1/ 30头份/0.2 ml）（2）豚鼠检验检验步骤：300400克豚鼠2只皮下注射2ml（含15头份）观察10日应全部健活疫苗稀释：50头份/瓶加ml生理盐水（10头份/ml）取3ml（10头份/ml 即30头份/3ml）加1ml生理盐水30头份/4ml即（15头份/2ml）2、效力检验检验步骤：1618克小鼠16只10只皮下注射0.2 ml（含

8、1/ 150头份）；对照6只14日后10免疫和3只对照各皮下注射C44-1株强毒液3040MLD；另3只对照注射1MLD观察10日：注射3040MLD的对照组小鼠应全部死亡；注射1MLD的对照组小鼠应至少死亡2只；免疫组小鼠应至少保护8只。疫苗稀释：50头份/瓶加ml生理盐水（10头份/ml）倍稀释（1头份/ml）倍稀释（1/ 10头份/ml即1/ 100头份/0.1ml即1/ 50头份/0.2ml）3倍稀释（1/ 30头份/ml 即1/ 150头份/0.2 ml）5、鱼病多联抗体苗一、种毒检验1、无菌检验2、蛋白含量测定三、注意事项：1、酶条有8孔和12孔两种规格2、移液器用完后调至最大量程

9、存放二、半成品检验1、无菌检验2、浓度检验（ELISA定量分析法：至少应为69ug/ml）三、成品检验 1、物理性状。2、无菌检验。5、剩余水分。 3、安全检验：检验步骤：57克，45月龄200尾 100尾腹腔注射10倍剂量；100尾不接种作对照 观察30日应全部健活，若有非特异性死亡，应不超过10尾，且接种组不得超过对照组。注：1.接种量10倍剂量4、效力检验：检验步骤：57克，45月龄200尾 60尾腹腔注射免疫；60尾浸泡免疫30日后分组攻毒 ：取未免疫的30尾做对照和腹腔注射免疫的60尾分3组（每组30尾：注射免疫的20尾，未免疫的对照10尾）；取未免疫的30尾做对照和浸泡免疫的60尾

10、分3组（每组30尾：浸泡免疫的20尾，未免疫的对照10尾）每种免疫方式分成的3个组，分别腹腔注射攻3种毒，每尾0.1ml(含5个LD50) 观察7日，结果判定：对照组应至少死亡70%；注射免疫组保护率至少应为60%；浸泡免疫组至少30%疫苗稀释：四、不完全佐剂检验（羊毛脂:石蜡油=1:9）1、 性状检测：不完全佐剂为淡黄色清亮液体。2、 无菌检验3、 安全检验：取体重57g、45月龄牙鲆鱼40尾，20尾腹腔注射50ul不完全佐剂；20尾不接种作对照，同条件饲养，观察30日，应全部存活。若有非特异死亡应不超过2尾，且接种组非特异性死亡不得超过对照组。五、用法用量1、注射型疫苗 用生理盐水将每一瓶

11、内疫苗稀释到25ml 再与25ml的不完全佐剂等量混合均匀用1ml注射器进行腹腔注射接种（50ul/尾，含疫苗量3.75ug）。2、浸泡型疫苗用生理盐水将药盒内3只瓶内的疫苗溶解混合后，倒入装有90升海水的容器内充分搅匀，将1000尾57g、45月龄的幼鱼分23批放入其中浸泡，每批30min。每尾鱼的疫苗量为11.25ug。（接种浸泡前，应停食至少24h，浸泡时向海水内充气。海水温度在1520为好。）六、贮藏与有效期：-25一下保存，有效期11个月。蛋白含量测定:LD506、鸡球虫病三价活苗一、半成品毒力返强试验检验步骤：将致弱处理的三种卵囊和一强毒株分别接种3日龄雏公鸡各10羽（每羽8000

12、个卵囊）共40羽接种67天后分别收取卵囊再将此卵囊接种3日龄雏公鸡各10羽（每羽8000个卵囊）照此方法连续传5代。强毒株对照组也以同样方法连续传5代。第5代接种47天后，剖杀所有试验鸡只，观察粪便和判定盲肠与小肠病变，结果判定：强毒组血便记分为+，强毒组病变记分为+3.5+4分；致弱组粪便记分不超过+，病变记分+1分，判为合格。二、成品1、安全检验检验步骤：将3日龄健康无球虫感染的雏鸡30羽分3组（10羽/组）分别用10倍和100倍使用剂量免疫其中2组，1组不接种作对照。结果判定：观察47天后，10倍量免疫组粪便记分为+，盲肠、小肠等部位病变记分在+1以下；100倍量免疫组无死亡，粪便记分为

13、+，盲肠、小肠等部位病变记分在+2+3，对照组无任何肉眼可见病变，疫苗判为合格。2、效力检验检验步骤：将3日龄健康无球虫感染的雏鸡40羽分2组（20羽/组）按免疫程序进行免疫，另20羽不免疫作对照。在第3次免疫后7天用9104个强毒卵囊/羽（含三种球虫各3104个强毒卵囊/羽）攻击两组鸡。结果判定：观察47天后，对照组粪便记分为+，病变记分为+4分，死亡率在50%以上；免疫组无血便，无死亡，病变记分在+1以下，疫苗判为合格。3、同笼试验检验步骤：将3日龄健康无球虫感染的雏鸡20羽分2组（10羽/组）1组按免疫程序进行免疫，另1组不免疫（做标记）。两组鸡一起平养，至第3次免疫后的47天，观察试验

14、鸡粪便并剖杀所有试验鸡，观察肠道病变。结果判定：所有试验鸡（含未免疫鸡）应无血便（+），盲肠、小肠病变记分均应在+1分以下，疫苗判为合格。支原体检验一、培养基1、检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗 用改良Frey氏培养基。2、检验其他种类细胞和病毒疫苗 用支原体培养基。3、检验血清 用无血清支原体培养基。二、检查法1、样品处理 每批样品取5瓶。液体制品混合后备用；冻干制品，则加液体培养基（）或生理盐水复原成混悬液后混合。检测血清时，用血清直接接种到不含血清的培养基内。2、培养基准备 2.1 液体培养基 将冷冻保存的液体培养基融化，分装到小瓶（100ml瓶），20ml/瓶；小管（1.0

15、cm10cm），1.8ml/支。 2.2 固体培养基 将固体培养基加热溶解，温度降至60左右时添加辅助液（添加时轻轻摇动，以免出现气泡）；按平皿规格（90）倒入适量培养基。 2.3 培养基需要量 每批样品需要用培养基：小瓶1个（液体）；小试管2支（液体），平皿2付（固体）。 阳性对照需要用培养基：小瓶1个（液体）；小试管2支（液体），平皿2付（固体）。 阴性对照需要用培养基：小瓶1个（液体）；小试管2支（液体），平皿2付（固体）。3、对照阳性对照 禽类疫苗用滑液支原体，其它疫苗用猪鼻支原体做阳性对照。 阴性对照 用同批培养基作阴性对照。4、疫苗检测（1）接种与观察取5ml疫苗混合物接种于装有2

16、0ml液体培养基的小瓶，摇匀后，再从小瓶中取0.8ml移植到2支小管液体培养基（0.2ml/支）；2付固体培养基（0.10.2ml/付）。液体培养物（小瓶与小管）置37培养，固体培养物（平皿）置含5%CO2培养箱培养。每日观察培养物有无颜色变化（变黄或变红），观察14日。分别于接种后5日、10日、15日从小瓶中取0.8ml培养物移植到2支小管液体培养基（0.2ml/支）；2付固体培养基（0.10.2ml/付）。每次移植培养物均观察14日。 在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管液体培养物颜色出现明显变化，即pH值变化达0.5时，应立即移植于小管液体培养基2支和固体培养基2付。观察移植的液体培养

17、基是否出现恒定的pH值变化；固体培养基培养3天后在40100倍显微镜下观察有无典型的“煎蛋”状支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落者时，停止观察。每次移植培养必须设阳性和阴性对照，在相同条件下培养观察。阳性对照：禽类疫苗用滑液支原体，其它疫苗用猪鼻支原体做阳性对照。阴性对照：用同批培养基作阴性对照。5、血清的检测取被检血清10ml接种90ml的无血清支原体培养基，培养基按6、检验操作示意图样品35ml20ml/瓶0.2ml/小管 14天 0.10.2 ml/平皿 5天 0.2ml/小管 14天 0.10.2 ml/平皿10天0.2ml/小管 14天 0.10.2 ml/平皿15天0.2ml/

18、小管 14天 0.10.2 ml/平皿三、结果判定1、阳性对照至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。2、接种样品的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落，液体培养基pH值发生变化时，判疫苗或血清不合格。（液体培养物：如有支原体污染，液体培养基因支原体生长变为淡黄色并浑浊。注意：被检物接种到液体培养基后，由于疫苗中保护剂的作用，经培养后，有时颜色发生变化，变淡发黄，但不浑浊，培养物透明，属于正常变化。在不能判断的情况下，进行移植培养，观察培养物是否出现恒定pH变化。 固体培养物：支原体在固体培养基上生长稍迟缓，接种37天后出现菌落，菌落非常小，直径在50100um之间，用

19、40倍左右显微镜观察，支原体菌落深入到琼脂面下生长发育，菌落中心侵进培养基深层，密集生长繁殖，在琼脂培养基的表面其边缘呈圆形，因此，菌落整体形态如油煎蛋状。注意：生物制品中污染的支原体，菌落并不像书上描述的典型菌落，而是呈圆形隆起，表面呈颗粒状，中心聚集如杨梅状，无外晕。只有经过多次传代后才能形成典型“油煎蛋”状菌落。）四、注意事项1、支原体检验要求的条件非常苛刻，所用器物必须清洁灭菌。2、检验操作时必须戴口罩；工作帽；穿洁净工作服，操作中尽量不说话，不来回走动。3、操作时绝对禁止用口吹吸管；口腔是口腔支原体感染的主要途径。4、检验结束后，开封的检品要经灭菌后再处理。外源病毒检验一、样品处理1

20、、种毒：鸡新城疫低毒力(LaSota) 种毒:种毒病毒含量/外源病毒检验时要求的含量（一般为10羽份/0.1ml）=该种毒的稀释倍数与等量抗血清中和鸡痘种毒：球虫种毒：2、成品：鸡新城疫低毒力活疫苗：取样3瓶（500羽/瓶）每瓶加M199溶液5 ml（100羽/ml即10羽/0.1ml）各瓶取样2ml混合（共6ml）取混合样2.5ml与2.5ml抗血清等量中和（37中和1h其间摇数次）鸡痘活疫苗：取样3瓶（500羽/瓶）每瓶加？5 ml（100羽/ml即10羽/0.1ml）混合样品冷冻离心（4,1200g,15min）取上清液经0.8um、0.45um、0.22um、0.1um滤器各过滤1次鸡

21、球虫病三价活疫苗：取样3瓶（500羽/瓶）混合样品冷冻离心（4,12000g,15min）取上清液经0.8um、0.45um、0.22um、0.1um滤器各过滤1次用M199溶液稀释至10羽/ml二、接种、观察及判定1、鸡胚检查法：10日龄SPF鸡胚20枚10枚尿囊腔(AS)，10枚尿囊膜(CAM)接种0.2 ml/胚37继续孵育，观察7日弃去24h内死胚（但每组须活8/10以上实验成立）结果：胎儿应发育正常，绒毛尿囊莫无病变；鸡胚液血凝试验应为阴性2、细胞检查法：6瓶长成良好单层的细胞瓶（100 ml容量瓶）2瓶接种已处理的样品0.2ml/瓶37吸附1h换上维持液（含25%犊牛血清的乳汉液）

22、；2瓶接LaSota病毒（104 EID50/瓶）；2瓶不接种作阴性对照37继续培养57天，每天观察应无任何CPE培养结束后，弃去培养液，用PBS( )轻洗细胞面3次每瓶细胞加0.1%（V/V）鸡红细胞液0.5 ml覆盖细胞面4放置1h再用PBS轻洗细胞面2次普通显微镜下观察：阳性对照应有典型红细胞吸附现象；阴性对照应无血球吸附现象；样品细胞不应出现红细胞吸附现象。鸡胚成纤维细胞（CEF）单层的制备10日龄SPF鸡胚无菌取出鸡胚于烧杯中去除头、四肢和内脏汉氏液洗涤胚体剪碎成米粒大小汉氏液洗涤23次加0.25%胰酶溶液（约4.0ml/胚）置38水浴消化2030min吸出胰酶溶液，用汉氏液洗涤23

23、次弃去汉氏液，加适量营养液（含5%犊牛血清的乳汉液，适量抗生素，一般500IU/ml）吹打成细胞悬液用多层（48）纱布（或80100目尼龙网）滤过制成100150万个/ml的活细胞悬液（一般估算不计数）分装到100ml细胞瓶中（1015 ml/瓶），37CO2培养箱（瓶口要稍微拧松，便于CO2进入细胞瓶）或恒温培养箱24h后形成单层细胞备用。禽白血病病毒（RAV）检验一、样品处理1、种毒：2、成品：鸡新城疫低毒力活疫苗：取样1瓶（500羽/瓶）加不含血清的M199溶液2ml（250羽/ml即200羽/0.8ml）取0.8ml（含200羽份）与0.8mlNDV抗血清等量中和（37中和1h其间摇数

24、次）全部接种到细胞瓶中问题：要不要离心取上清液后再中和鸡痘活疫苗：取样2瓶（500羽/瓶）加不含血清的M199溶液2ml/瓶（250羽/ml即500羽/2ml）混合样品冷冻离心（4,12000g,15min）取上清液经0.8um、0.45um、0.22um和0.1um滤器各过滤1次取滤液2ml（相当于500羽份）用于接种CEF冷冻离心（4,12000g,15min）？球虫苗：3、细胞液：二、接种与培养CPE接种后，37吸附1h弃去接种液，加生长液（含510%犊牛血清的乳汉液）次日换成维持液（含25%犊牛血清的乳汉液）注：同时设立正常细胞作阴性对照；禽白血病病毒（RAV）作阳性对照。阳性对照：对

25、照分两组，每组2瓶CEF，弃去生长液（保留1 ml原培养液）两组对照分别加入RAV1和RAV2各0.5 ml37吸附1h直接加入培养液（？）（不用弃去原来液）同样品连传3代（传代时病毒对照要在最后进行）试剂盒生产厂家，操作方法等三、细胞传代与处理待细胞培养57日后弃去细胞瓶中的液体，加适量胰酶EDTA消化液室温静置25min至细胞松散弃细胞消化液，静置2min加入适量营养液（ ）使细胞悬浮将1/2细胞收集到试管中标记P1放-70另外1/2细胞分散到两个25ml容量细胞瓶中，加入培养液使之混匀同样培养至57日继续传代处理为P2和P3代，所有对照细胞瓶同样传代，阳性病毒对照应最后处理四：结果判定（

26、ELISA试验）1、样品处理将收获的细胞培养物冻融3次3000rpm离心5min取上清液作被检样品2、试验操作将试剂盒中所有成份回复到室温加样：每孔100ul被检样品，设阳性、阴性对照孔，每个样品加两孔，密闭（用封口膜封板）放置37作用1h洗涤：弃去样品，每孔加300ul洗涤液，放置1min，弃去洗涤液（含0.1%吐温-20的PBS即PBS-T）洗45次300ul/次，每次洗板要尽量弃尽洗涤液加酶标抗体：每孔100ul，密闭（用封口膜封板）放置37作用1h洗涤：同上加显色液：将试剂盒中的A液和B液等体积混合均匀后，每孔加100ul室温避光10min加终止液：每孔加100ul读数：用酶标仪在65

27、0nm波长下读取OD值（置酶联读数仪测定各孔OD650nm值）结果判断：当阴性对照OD650nm值小于0.2，阳性对照OD650nm值大于0.4时试验结果成立；被检样品OD650nm值大于0.3判为阳性，0.2OD650nm值0.3判为可疑，OD650nm值小于0.2判为阴性。对可疑样品应进行重检，重检仍为可疑判为阴性。注意事项：1 试验过程中使用的吸头、容器等均要保证清洁；2 加终止液后尽快读数；3 每次的弃液应经无害化处理（?）。禽网状内皮组织增生症病毒（REV）检验一、样品处理样品处理同禽白血病病毒检验法。二、接种与培养处理好的样品接种1个25cm2左右的CEF单层置37吸附1h弃去接种

28、液，用含3%牛血清的M-199培养液洗CEF单层2次（2ml/次）每瓶细胞加78ml含3%牛血清的M-199培养液，37培养7日。同时设立正常细胞作阴性对照；将鸡禽网状内皮组织增生症病毒（REV）至10TCID50/ml，取1.0ml接种至CEF作为阳性对照。稀释10TCID50/ml三、细胞培养的传代及处理1、含鸡痘病毒（FPV）的制品a、第一代培养物的处理 第一代检品培养物、病毒对照培养物及细胞对照培养物的细胞培养液，均无菌弃去23ml，使细胞培养瓶中剩余5ml然后将细胞瓶中的CEF单层及细胞培养液冻融3次，充分吹吸使细胞脱壁。细胞悬液于4,5000g离心10min，取上清液经0.1um滤

29、膜过滤1次，滤液用于下一步检验。b、接种CEF细胞取上述处理好的样品滤液0.4ml用于接种已长成良好CEF单层的48孔细胞培养板，每个样品接种4孔，每孔0.1ml。剩余滤液全部接种于1个已长成良好CEF单层的细胞培养瓶中，37吸附1h。然后48孔板中每孔补加0.4ml含2%牛血清的M-199细胞培养液，细胞瓶弃去吸附液，每瓶加78ml含2%牛血清的M-199细胞培养液。细胞培养板接种后置5%CO2、37继续培养5天，然后进行荧光染色。细胞培养瓶接种后置37继续培养7天。c、细胞传代当接种的细胞培养板经荧光染色，判定为REV检测阳性时，细胞培养瓶培养物不必继续传代，否则按（2、其他制品及细胞液）

30、方法传代2、其他制品及细胞液细胞培养7日后，按常规方法消化、收获细胞，将其中1/10的细胞用2ml含3%牛血清的M-199细胞培养液悬浮，接种4孔48孔板，每孔接种0.5ml。剩余细胞作好标记置-15保存备用。接种细胞的48孔板置5%CO2、37继续培养5日，然后进行荧光染色。四、荧光染色1、固定 弃去48孔板的细胞培养液，每孔约加0.5mlPBS（pH7.2下同）轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入0.3ml冷甲醇，置室温固定1015min，弃去甲醇，自然晾干（25min）。2、加鸡抗REV单特异性抗体 自然晾干后，用PBS（pH7.2）洗细胞面1次，然后每孔加入0.1ml用PBS

31、（pH7.27.4）进行适当稀释的鸡REV特异性抗体，置37作用1h。3、洗涤 弃去鸡抗REV特异性抗体，先用含0.05%吐温-20的PBS（pH7.2）洗3次，每次每孔加入洗液0.5ml，轻微振荡洗涤1min。然后用PBS（pH7.2）以同样的方法洗2次。4、荧光二抗染色 尽量弃尽洗液，每孔加入0.1ml用PBS（pH7.2）进行适当稀释的FITC标记的兔抗鸡IgG，置37作用1h。5、洗涤 同3。五、观察 在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光（波长490nm）观察。染色后立即观察效果最好，在湿盒中4避光保存1周内观察。被感染的CEF细胞（典型的成梭状，但多数呈不规则型）呈绿色荧光，有完整的细胞形态，周围未被感染的细胞不着色，视野发暗。放大到200400时，可见被感染细胞胞浆着色，细胞核不着色，胞核的位置相对较暗。六、结果判定1、当阳性对照接种的4个孔中全部出现特异性绿色荧光，阴性对照接种孔均未出现特异性绿色荧光时，检验结果成立；否则检验结果不成立，需要重新检验。2、被检样品接种的4个孔中，只要有1孔出现特异性绿色荧光，即判定该样品中REV阳性，样品外源病毒检验结果判为不符合规定。