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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流植物成分分析.精品文档.实验一、分离鉴定植物组织中的氨基酸目的意义层析分离技术（或称色层分析技术）是一种物理分离技术，是利用混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子大小和形状、分子亲和力、分子极性、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，达到分离的目的。根据层析方法所依据的理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、排阻层析、亲和层析等。根据固定相支持剂的质地和形状等的不同，层析技术可分为纸层析、薄层层析、薄膜层析、柱层析等。层析分离技术因其操作简便，不需要很复杂的设备，样品用量可大可小，故既可用于实验室的
2、分离分析，又适用于工业生产中产品的分离制备。它与光学仪器配合，可组成各种自动化分离分析仪器，进一步显示了层析分离技术的优越性。在生化技术领域里，层析技术已成为一项最常用的分离分析方法。此项技术可用于研究物质组成和分离纯化各种成分。通常用于分离分析氨基酸、核苷酸、糖类、激素、维生素等成分。其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质，设备简单，操作容易，样品用量少，结果较准确。本实验目的在于掌握层析法的一般原理和操作技术，学会氨基酸的鉴定方法。一、纸层析法（一）原理纸层析是分配层析的一种，即以分配系数的不同，使不同物质在不同相中不同程度地分配，从而达到分离的目的。 一种物质在不同的溶
3、剂中具有不同的溶解度。所谓分配系数就是一种溶质在两种存在于同一系统而相互不溶的溶剂中溶解达到动态平衡时，溶质在两相中的浓度比值，通常用表示：各种物质的分配系数在一定条件下是一个常数。将两种溶剂中的一相用一种支持剂加以固定，称为固定相。让另一相从这相上流过，称为流动相。这样，分配系数可表示为： 纸层析是以滤纸作支持剂的分配层析。层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸附22左右的水，而与有机溶剂的亲和力很弱，它可以在纸的毛细管中流动。因此，以水作固定相，而以与水不相溶的有机溶剂作流动相。层析时，将滤纸的一端浸入展层剂中，有机溶剂就会连续不断地通过点有样品的原点处，使
4、其中的溶质依据其本身的分配系数不断地在两相间进行分配。分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。 溶质迁移的速度用迁移率表示，符号为。 各种化合物在恒定的条件下，经层析后都有其一定的值，即在层析图谱中有一定的位置。借此可以达到分离和鉴定
5、的目的。决定值的因素主要是分配系数，而分配系数受以下因素的影响：1. 物质极性的大小：水的极性很强，一般极性强的物质容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。如侧链含极性基团的氨基酸易分配在水相中，值较小，而侧链含非极性基团的氨基酸易分配在有机相中，值较大。2. 滤纸的质地以及为水饱和的程度：滤纸的质地必须均一，纯净，厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。3. 溶剂的纯度、pH值和含水量：pH值和含水量的改变可使氨基酸和展层剂的极性改变，值也随之改变。4. 层析的温度和时间：温度改变，使溶剂中有机相含水量改变，值也改变。当所有条件相同时，层析时间短，则值小。因此，
6、层析过程中对以上影响因素要严格控制。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：绿豆芽。2. 仪器：吹风机、层析缸、培养皿、毛细管、针线、尺子、曲别针、新华1号滤纸等。3. 试剂：（1） 标准氨基酸溶液：0.1的赖氨酸（Lys）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）及上述各种氨基酸溶液等体积的混合液。（2） 展层剂及显色剂：按正丁醇:95乙醇:冰乙酸:水4:1:1:2配成展层剂后，再以其配成0.1的水合茚三酮试剂。（三）操作步骤1. 点样：取新华1号滤纸一张，于距一端2cm处用铅笔画一道直线，并均匀分出
7、11个点，其中8个点分别点8种标准氨基酸（各点45次），1个点点混合氨基酸（78次），2个点点样品（78次）。样品的点法是掰开绿豆芽下胚轴，挤出一些汁液，用毛细管吸一些点样即可。2. 层析：取大小合适的层析缸一个，其底部放上直径为10cm左右的培养皿。向培养皿中加入约1.5cm深的展层剂，盖严，平衡20min。将点好样的滤纸卷成筒状，用曲别针或针线缝合固定两点（注意不要使滤纸的两边重叠）。将滤纸点样端朝下，点样面向外放入培养皿中，盖严层析缸，开始层析。待展层剂前沿到达距上端3cm左右时（约45h），层析停止，取出滤纸，用铅笔画下前沿线。3. 显色：用吹风机热风将滤纸吹干，其上的氨基酸便与展层剂
8、中的显色剂茚三酮发生颜色反应，显出蓝紫色斑点，其中脯氨酸显黄色。4. 分析：用铅笔描绘出色斑轮廓，计算各样点的值，依据值及颜色与标准氨基酸比较，鉴定出各样点的氨基酸名称，并得出绿豆芽中所含游离氨基酸的种类。 二、薄层层析法（一）原理薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。薄层层析的作用机理主要包括吸附、分配、离子
9、交换和凝胶过滤等作用。当样品组分在薄板上进行分离时，这几种作用产生不同的影响，究竟哪种作用为主，须视情况而定。在吸附薄层层析中，因样品组分极性有差异，故不同组分与吸附剂和展层剂的亲和力就有差别，从而导致各组分在薄板上的移动距离不同，组分与吸附剂亲和力强的留在接近原点的位置；反之，组分与吸附剂亲和力弱的留在离原点较远的位置，即亲和力愈弱，移动愈远，于是样品中各组分就得到分离。按照相似溶解相似规律，极性组分易溶于极性溶剂中；非极性组分则易溶于非极性溶剂中，因此在同一薄板上，不同极性化合物的组分在同一溶剂中的溶解度不同，溶解度愈大，移动的速度愈快；否则反之。展层的过程即样品各组分得到分离的过程，它也
10、是一个吸附，解析，再吸附，再解析的连续过程。同一种物质具有相同的Rf值，不同物质有不同的Rf值，因而达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，就可以鉴定样品中各种氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅和大小可以确定氨基酸的含量。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：绿豆芽。2. 仪器:薄层涂布器、研钵、试管、烘箱、真空干燥器、微量注射器、玻璃缸、喷雾器等。3. 试剂：（1）展开剂：甲酸：叔丁醇：甲乙酮：氨水：水（5：3：1：1，VV）。（2）展开剂：异丙醇：甲酸：水（ 2 0：1：5，VV）。注意：以上两种展开剂临用时配。（3）05茚三酮丙酮溶液。（4）羧甲基纤维素或微晶纤
11、维素。（5）标准氨基酸（2mgmL）。（三）操作步骤（1）薄层板制备：称取10g微晶纤维素，加入20mL蒸馏水和2.5mL丙酮，研磨1min,用薄层涂布器涂布于干净的玻璃板上。其厚度以300500mm为适(比一般薄板厚一些），凉干后即可使用。（2）样品液制备：称取样品5mg，放入小试管中，加入5.7N盐酸（恒沸点盐酸）0.6mL。在火焰上熔融封口后，置于110烘箱中水解24h。取出，打开封口于真空干燥器中减压抽干，以去掉过多的盐酸，以稀氨水调节至Ph7左右，加入10异丙醇最后达0.5mL，置于冰箱中备用。（3）点样：用微量注射器取样液5mlspl，滴加在距薄板下边2cm处，点样直径在23mm内
12、为宜。（4）展开：将已点样的薄板，放入有展开剂的玻璃缸里，先进行碱向展开，当溶剂前沿到达10cm时（约6080min），将薄板取出，冷风吹干。再进行酸向展开，将薄板放入有展开剂的玻璃缸中，展开至距离原点10cm时，取出吹于。(5)显色；以0.5茚三酮液喷雾于薄层板上，喷得薄板湿润并无液滴流下。将薄板吹干，有氨基酸的地方显出蓝紫色斑点，只有脯氨酸为黄色斑点。用笔将斑点圈出或用描图纸复绘保存。（6）标准氨基酸按上述步骤进行点样，展开显色。各种氨基酸层析图谱【附注】1. 点样时样点不要过大，直径以不超过5mm为宜，最好掌握在23mm。每点一次，要等其干后再点下一次（可用吹风机吹干），以防样点直径过大
13、。 2. 毛细管不要乱用，以防将标样弄混。3. 手要洗凈，并注意拿着滤纸的上端，以防将纸面污染。4. 吹干时时间不宜过长，以免将样点吹糊。5. 为了定量还可以点上不同浓度的氨基酸标准液，供比较和确定样品中氨基酸的含量。计算：氨基酸含量（mgkg）=定容体积（mL）/样品（g）相当标准氨基酸(mg)/滴样（mL）实验二 蛋白质含量的测定目的意义蛋白质不仅是植物的结构物质（如生物膜），而且是植物的生理活性物质（如酶），同时也是植物的重要贮藏物质，是维持植物生命活动所必需的。测定植物组织中及籽粒中蛋白质的含量，对于了解植物体中蛋白质代谢状况和农作物品种的品质有重要意义。本实验目的是学习测定蛋白质含量
14、的原理和方法。一、改良双缩脲法（一）原理 本法是延用已久的蛋白质含量快速测定法，常用于谷物蛋白质含量的测定。双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中能与Cu2产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与Cu2发生双缩脲反应，即Cu2与肽键中失去氢原子的氮原子相结合而生成紫红色络合物（在550nm处有一吸收峰），其颜色深浅在一定范围内与蛋白质含量成正相关，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关，且络合物的颜色相当稳定。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：谷物与豆类种子经风干、磨碎并过100目筛。2. 仪器：分光光度计、恒温箱、康氏振荡器、离心机、天平、
15、移液管、具塞三角瓶等。3.试剂：（1）50mmolL-1 KOH溶液（2）双缩脲试剂：量取蒸馏水920mL，加10molL-1 KOH溶液10mL和25酒石酸钾钠20mL，摇匀后在剧烈搅拌下加4CuSO4溶液50mL，密封保存。如有沉淀析出，则需重新配制。（3）蛋白质标准溶液：精确称取70下恒重的纯酪蛋白或牛血清白蛋白1.0000g，溶于50mmolL-1 KOH溶液中，定容至100mL，其浓度为10mgmL-1，保存在冰箱中。（三）操作步骤1. 标准曲线制作：取6支干燥试管，编号后按下表添加试剂，摇匀后于25温箱中静置1h，使其充分显色。然后在550nm波长下比色，读取消光值。以消光值为纵坐
16、标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准蛋白溶液（mL）50mmolL-1 KOH（mL）蛋白质浓度（mgmL-1）双缩脲试剂（mL）消光值01.0040.20.8240.40.6440.60.4640.80.2841.001042. 样品测定： （1）将磨碎过筛的样品在80下烘至恒重，取出置于干燥器中冷却待用。（2）称取烘干样品0.51g，放入干燥的三角瓶中，加入50mmolL-1 KOH溶液10mL，摇匀，相当于样品液10mL。再加入双缩脲试剂40mL，加塞盖严，在振荡器上振荡10min，再于25温箱中保温显色1h，4000rpm离心10min，取上清液于550nm下
17、比色，记录消光值。（四）结果计算式中：为蛋白质含量（mgg-1）；为从标准曲线上查得蛋白质浓度（mgmL-1）；为样品液体积（mL）。二、斐林（Folin）酚法（一）原理 本法是一种灵敏度极高的快速测定蛋白质含量的方法（测定范围为5100g），尤其适用于不溶性蛋白质含量的测定。Folin酚试剂由两部分组成：试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物而呈蓝色反应。由于蛋白质中存在含酚基的氨基酸，故也有此反应，其颜色深浅与蛋白质含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
18、由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：各种植物材料。2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、冷凝回流装置、容量瓶、具塞刻度试管、移液管等。3. 试剂：（1）0.5M NaOH（2）试剂甲：称取10g Na2CO3、2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠用蒸馏水溶解后定容至500mL，为 A液；称取0.5g硫酸铜（CuSO45H2O）用蒸馏水溶解后定容至100mL，为B液。每次使用前将A液50份与B液1份混合，即为试剂甲。此混合液有效期1天。（3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入钨酸钠（Na2WO42H2O）100g、钼酸钠（N
19、a2MoO42H2O）25g及蒸馏水700mL，再加85磷酸50mL、浓盐酸100mL充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL及数滴液体溴，开口继续沸腾15min ，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，需再重复滴加液体溴数滴，继续沸腾15min），稀释至1000mL，过滤，滤液贮于棕色试剂瓶中。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1molL-1酸度。（4）标准牛血清白蛋白溶液：精确称取牛血清白蛋白25mg，加少量蒸馏水溶解后定容至100mL，其浓度为250gmL-1。（三）操作步骤1. 标准曲线制作：取6支试管，编号，按下表添加试剂，
20、混合后于室温下放置10min，再各加0.5mL试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱），30min后于650nm波长下比色，记录消光值。以消光值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（gmL-1）试剂甲（mL）01.0050.20.85050.40.610050.60.415050.80.220051.0025052. 样品提取：称取鲜样0.51.0g于研钵中，加蒸馏水2mL，研成匀浆，转入离心管，并用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，一并转入离心管，4000rpm离心20min。弃去沉淀，上清液定容至10m
21、L，即为待测液。3. 样品测定：取待测液1mL放入具塞试管中，加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，然后加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温下放置30min，于650nm波长下比色，记录消光值。（四）结果计算式中：为蛋白质含量（mgg-1）；为从标准曲线上查得蛋白质浓度（gmL-1）；为提取液总体积（mL）；为样品重（g）。【附注】1. 因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。2. 还原物质、其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。三、考马斯亮蓝G-250染色法（一）
22、原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者吸收峰在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质范围内（01000gmL-1），蛋白质色素结合物在595nm波长下的消光值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏（比斐林酚法还高4倍），可测微克级蛋白质含量，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的蛋白质定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏
23、低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：小麦叶片及其他植物材料。2. 仪器：分光光度计、离心机、药物天平、容量瓶、移液管、试管等。3. 试剂（1）100gmL-1标准牛血清白蛋白溶液：精确称取牛血清白蛋白10mg，溶于100mL蒸馏水中。（2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入100mL 85磷酸（W/V），最后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中。此溶液在常温下可放置一个月。（3）其他试剂：90乙醇、85磷酸。（三）操作步骤1. 标准曲线制作：取6支试管，按下表添加试剂。摇匀，放置2
24、min后在595nm波长下比色，记录消光值。以消光值为纵坐标，牛血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（gmL-1）考马斯亮蓝G-250（mL）消光值01.0050.20.82050.40.64050.60.46050.80.28051.0010052. 样品提取：称取鲜样0.51.0g放入研钵中，加2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL容量瓶中，再以蒸馏水分次洗涤研钵，收集于同一容量瓶中，用水定容至刻度，放置30min以充分提取，其间摇动几次。然后过滤或离心，清液即为待测液。3. 样品测定：吸取提取液1mL，放入试管中，加5m
25、L考马斯亮蓝G-250试剂，充分摇匀，放置2min后于595nm处比色，记录消光值。（四）结果计算式中：为蛋白质含量（mgg-1）；为从标准曲线上查得蛋白质浓度（gmL-1）；为提取液总体积（mL）；为样品重（g）。四、紫外吸收（UV）法（一）原理蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收值是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm的吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。核酸在紫外区（260nm）也有吸收，可通过校正加以消除。（二）实验材料、仪器与试剂 1. 实验材料：小麦叶片及其他植物材料。 2.
26、 仪器：紫外分光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、移液管、试管等。 3. 试剂：0.1molL-1 pH 7.0磷酸缓冲液（三）操作步骤 1. 样品提取：称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000rpm离心10min，上清液为待测液。 2. 测定：取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用0.1molL-1 pH 7.0磷酸缓冲液适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度，以pH 7.0磷酸缓冲液为空白调零。（四）结果计算式中：为蛋白质浓度（mgmL-1）；1.45和0.74为校正值；为蛋白质溶液在280nm处的吸光度；为蛋白质溶液在260nm
27、处的吸光度；为稀释倍数；为样品重（g）。实验三 还原糖、总糖、可溶性糖含量的测定还原糖和总糖含量测定：一、目的意义糖是植物组织中含量最丰富的化合物。还原糖可以合成非还原性糖，非还原糖也可以 分解成还原性糖。测定植物组织中总糖及还原糖的含量，能帮助我们了解植物糖代谢状况。本实验的目的是掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习3,5二硝基水杨酸法测定糖含量的基本操作。二、原理各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使无还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖与3,5二硝基水杨酸共热，3,5二硝
28、基水杨酸被还原为3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。如果在测定前先用盐酸对样品进行水解，所测得的即为总糖含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算总糖时须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。三、实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：面粉或其它植物材料。2. 仪器：分光光度计、离心机(过滤法不用此设备)、扭力天平、恒温水浴、具塞刻度试管、大离心管或玻璃漏斗、烧杯、三角瓶、容量瓶
29、、移液管等。3. 试剂（1）1mgmL-1葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。（2）3,5二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5二硝基水杨酸和262mL 2M NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。（3）碘碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。（5）6M H
30、Cl（6）6M NaOH四、操作步骤（一）制作葡萄糖标准曲线取7支25mL具塞刻度试管，按下表加入试剂。摇匀，沸水浴加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度，塞住管口，颠倒混匀（如用普通大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀)。在540nm波长下，用1号管调零，分别读取各管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号1234567葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）葡萄糖浓度（mgmL-1）3,5二硝基水杨酸（mL）消光值02.001.50.21.80.11.50.41.60.21.50.61.40.31.50.81.2
31、0.41.51.01.00.51.51.20.80.61.5（二）样品中还原糖和总糖含量的测定1. 样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100mL饶杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20mL蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。如为鲜样，称取1g于研钵中研磨成匀浆，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，室温下浸提3060min，其间经常摇动，然后离心或过滤，弃去残渣，清液即为还原糖待测液。2. 样品中总糖
32、的水解和提取：准确称取1g食用面粉，放在100mL三角瓶中，加入10mL 6M HCl及15mL蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30min。取12滴水解液于白瓷板上，加1滴碘碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以6M NaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10mL定容过的水解液，移入另一100mL容量瓶中，定容，混匀，作为总糖待测液。3. 测定：取4支25mL具塞刻度试管，编号，按下表填加试剂。其余操作与标准曲线制作相同，测定各管的消光值。试
33、管编号还原糖1还原糖2总糖1总糖2还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）3,5二硝基水杨酸试剂（mL）消光值2001.52001.50111.50111.5五、结果计算以管1、2消光值的平均值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖浓度，按下式计算样品中还原糖和总糖的百分含量。式中：为从标准曲线上查得还原糖的浓度（mgmL-1）；为提取液总体积（mL）；为样品重（mg）。可溶性糖含量的测定：一、目的意义可溶性糖多是带有甜味的一些糖分，如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等。可溶性糖含量是果实品质的一项重要指标，果实成熟过程中可溶性糖含量增加。可溶性糖也是植物细胞渗透调节物质之一，干旱条件下植物
34、组织中可溶性糖含量增加。测定可溶性糖含量可用于分析果实品质，了解植物的生理状况。本实验目的在于掌握蒽酮比色法测定可溶性糖含量的原理及操作。二、原理己 糖 羟甲基糠醛糖（sugar）在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，其吸收峰为620nm。在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。糠醛衍生物（蓝绿色）羟甲基糠醛蒽 酮戊 糖 糠 醛该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反
35、应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。这一方法灵敏度很高，糖含量在30g左右就能进行测定，所以可作为微量测糖之用。一般
36、样品少的情况下，采用这种方法比较合适。三、实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：各种植物组织，如根、茎、叶、果实、种子等。2. 仪器：分光光度计、天平、水浴锅、离心机或漏斗、具塞刻度试管、容量瓶、移液管等。3. 试剂：（1）50gmL-1标准蔗糖溶液：准确称取蔗糖50mg，加蒸馏水溶解后定容至1000mL。（2）蒽酮试剂：称取蒽酮0.2g溶于100mL浓硫酸中。贮于棕色瓶，暗中可保存2周。四、操作步骤1. 标准曲线的制作：取6支大试管，按下表数据添加试剂。立即摇匀，反应10min，在620nm波长下比色。以标准蔗糖浓度作横坐标，以消光值作纵坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准蔗糖溶液（m
37、L）蒸馏水（mL）蔗糖浓度（gmL-1）蒽酮试剂（mL）02.0040.41.61040.81.22041.20.83041.60.44042.005042. 样品提取：将植物组织烘干、粉碎，准确称取50250mg，放入具塞刻度试管中，加80乙醇1015mL，沸水浴提取30min。离心后收集上清液，其残渣再加80乙醇1015mL 重复提取2次，合并上清液。如系绿色组织，提取液需加少量活性炭于70下脱色、过滤，定容至50mL待测。如为鲜样，称取0.51g，加少许石英砂研磨成匀浆，连同残渣一起用蒸馏水定容至100mL，室温下浸提3060min，其间经常摇动，离心或过滤，弃去残渣。测前适当稀释。3.
38、 样品测定：吸取2mL提取液于大试管中，加入4mL蒽酮试剂，摇匀，10min后于620nm处比色，记录消光值，从标准曲线上查出蔗糖的浓度。五、结果计算式中：为从标准曲线上查得的蔗糖浓度（gmL-1）；为样品总体积（mL）；为样品重（mg）。【附注】提取可溶性糖所剩残渣放在80烘箱中烘干，可用于测定淀粉和纤维素。实验四 维生素含量的测定一、目的意义维生素（Vitamin C）又称抗坏血酸（ascorbic acid），是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病。水果、蔬菜是供给人类维生素的主要来源。不同栽培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中维生素的含量。维生素含量是评价果蔬品质的重要
39、指标之一。本试验的目的在于学习维生素C含量的测定方法及原理。二、原理维生素C具有很强的还原性，染料2,6二氯酚靛酚（2,6 dichlorophenol indophenol）具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此当用蓝色的碱性2,6二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时，其中的抗坏血酸可以将2,6二氯酚靛酚还原成无色的还原型。但当溶液中的抗坏血酸完全被氧化之后，则再滴2,6二氯酚靛酚就会使溶液成红色，此时即为滴定终点。根据滴定用去的2,6二氯酚靛酚2,6-二氯酚靛酚（红色）（蓝色）抗坏血酸 脱氢抗坏血酸还原型2,6-二氯酚靛酚（无色）溶液的量，即可计算出被
40、测样品中抗坏血酸的含量。三、实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：新鲜水果或蔬菜。2. 仪器：蒸发皿、研钵、移液管、漏斗、滤纸、容量瓶、微量滴定管等。3. 试剂：（1）2草酸：称取10.0g草酸溶于少量蒸馏水中，定容至500mL。（2）2,6一二氯酚靛酚（NaOC6H4NC6H2Ocl2，相对分子质量为290.09）：将50mg 2,6一二氯酚靛酚染料溶解于200mL含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后，定容至250mL，装入棕色瓶内，放在冰箱里保存（因该染料性质不稳定，配制后超过一周必须重新配制）。（3）标准抗坏血酸溶液：将50mg纯抗坏血酸溶于少量2草酸溶液中，然后用2草酸溶液定容至5
41、00mL（使用前临时配制）。四、操作步骤1. 提取：称取水果或蔬菜样品10g，放在研钵中加入2草酸溶液约5mL研碎。通过漏斗将研碎的样品倒入一只100mL的容量瓶中，研钵用2草酸冲洗，并将洗液一并倒入该容量瓶中，最后用2草酸定容到刻度。过滤，滤液备用。2. 标定：取10mL标准抗坏血酸溶液至蒸发皿中，以2,6一二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为终点。计算lmL染料相当于抗坏血酸的mg数（重复3次，取平均值）。3. 滴定：取滤液10mL于蒸发皿中，用已标定过的2,6一二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并且在30s内不褪色为止，记下染料的用量（重复3次，取平均值）。五、结果计算式中：为样品
42、中抗坏血酸含量（mg100g-1）；为空白滴定所用染料量（mL）；为样品滴定所用染料量（mL）；为样品重（g）；为样品滴定吸取溶液体积（mL）；为样品溶液定容后的总体积（mL）；为与lmL染料溶液相当于抗坏血酸的mg数；为抗坏血酸的浓度（mgmL-1）；为标定用抗坏血酸的体积（mL）；为标定消耗染料的体积（mL）。【附注】样品中含有的其它还原性杂质也能还原2,6二氯酚靛酚，但一般杂质还原2,6二氯酚靛酚的速度均较抗坏血酸慢，因此，将粉红色能存在15s以上定为滴定终点。实验五 植物可滴定酸的测定植物可滴定酸度是植物品质的重要构成性状之一，尤其是以果实为目的产品的果树作物，可滴定酸与糖一样，是影响
43、果实风味品质的重要因素。对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；对于加工品种，则要求高糖高酸。因此，可滴定酸的定量研究对果树的品质育种具有重要意义。一、试材及用具 1试材 新鲜或冷冻的植物材料 2仪器 高速组织捣碎机(1000012000r/min)、电子天平（感量0.01）、电热恒温水浴锅；50mL移液管、100、60mL烧杯、250mL容量瓶、7cm漏斗、250mL锥形瓶、50mL碱式滴定管等玻璃仪器及12.5cm快速滤纸等。 3试剂 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液、酚酞指示剂及10g/L的95% 乙醇溶液等。二、原理 本实验的主要原理:试样浸出液以酚酞为指示剂，用0.1mol
44、/L氢氧化钠标准溶液滴定。本试验用水应是不含二氧化碳的或中性蒸馏水，可在使用前将蒸馏水煮沸、放冷，或加入酚酞指示剂用0.1mol/L氢氧化钠溶液中和至出现微红色。有些果蔬样液滴定至接近终点时出现黄褐色，这时可加入样液体积的12倍热水稀释，加入酚酞指示剂0.51mL，再继续滴定，使酚酞变色易于观察。通过实验，学习并掌握用指示剂滴定法测定样品可滴定酸的原理和方法。 三、方法步骤 1样品提取液制备 剔除试样的非可食部分（冷冻制品预先在加盖的容器中解冻），用四分法分取可食部分切碎混匀，称取250g，准确至0.1g，放入高速组织捣碎机内，加入等量水，捣碎12min。每2g匀浆折算为1g试样，称取匀浆50
45、100g，准确至0.1g，用100mL水洗入250mL容量瓶，置7580水浴上加热30min，期间摇动数次，取出冷却，加水至刻度，摇匀过滤。 2测定 根据预测酸度，用移液管吸取50或100mL样液，加入酚酞指示剂510滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，至出现微红色30S内不退色为终点，记下所消耗的体积。 3结果计算 试样的可滴定酸度以每100g或100mL中氢离子毫摩尔数表示，按下式计算： 可滴定酸度mmol/100g(mL)=（cV1）/V0250/m(V)100 式中：c氢氧化钠标准溶液摩尔浓度 V1滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液体积(mL) V0吸取滴定用的样液体积(mL) m(V)试样质量(g)或体积(mL) 250试样浸提后定容体积(mL) 实验六 黄酮的含量测定黄酮是植物的次生代谢物质，具有抗氧化、抗衰老的作用，在医药上可用于防治心脑血管疾病、动脉硬化等，作为天然保健产物具有广泛的开发应用前景。测定方法标准曲线的绘制：精密称取芦丁对照品 25 mg，置于 50 mL 容量瓶中，加乙醇适量，置于30 水浴锅中加热，使之完全溶解，放冷后用乙醇定容，摇匀。精密量取 20 mL配制好的芦丁乙醇溶液，置于 50 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，即得芦丁标准液。精密量取标准溶液 1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分