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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流氯胺酮对哮喘大鼠肺内一氧化氮及一氧化氮合酶的影响.精品文档.雾化吸入氯胺酮对哮喘大鼠肺组织一氧化氮及一氧化氮合酶的影响田伟千，傅诚章，朱敏敏，李海霞（南京医科大学第一附属医院麻醉科，江苏 南京 210029）【摘要】目的通过建立大鼠支气管哮喘模型,观察不同浓度氯胺酮对哮喘大鼠肺组织iNOS 活性及NO 含量的影响。方法 SD 大鼠随机分成对照组(N 组) 、哮喘模型组(A 组) 、不同浓度氯胺酮预处理组(分别为K1 组、K2 组)和地塞米松组（D组） ,每组8 只。A 组大鼠用卵白蛋白辅以百日咳杆菌菌苗和氢氧化铝为佐剂注射致敏,2 周后雾化吸
2、入卵蛋白激发哮喘；氯胺酮处理组大鼠用同样方法致敏,但在激发前分别给予雾化吸入氯胺酮25 g/ L ( K1 组) 和50 g/ L ( K2组) ；D组在激发前给予雾化吸入0.01%地塞米松；N 组用生理盐水替代卵蛋白进行注射和吸入。每组分别测定其肺组织NO2/NO3 水平、肺组织诱导型NOS（iNOS）和原生型NOS（cNOS）活性水平，并用免疫组织化学法观察iNOS在大鼠哮喘模型肺组织中的分布。结果A 组肺组织中NO2/NO3和iNOS水平升高，iNOS和肺组织NO2/NO3水平呈高度正相关;K1、K2组肺组织中NO2/NO3和iNOS水平低于A 组( P 0.05) ；D组肺组织中NO2
3、/NO3和iNOS水平亦低于A 组( P 0.05)。结论25 g/ L 或50 g/ L 的氯胺酮雾化吸入可抑制哮喘大鼠肺组织iNOS 活性,降低NO 含量,减轻大鼠肺部炎症。【关键词】氯胺酮；一氧化氮；一氧化氮合酶；哮喘 Effect of aerosolized ketamine inhalation on nitric oxide and nitric oxide synthase in the lung tissue of rat with asthma Tian Weiqian , Fu Chengzhang ,Zhu Minmin , et al . Department of
4、Anesthesiology ,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University , Nanjing 210029 CHINA【Abstract】Objective To observe the effect of aerosolized ketamine inhalation on nitric oxide and nitric oxide synthase in the lung tissue in rat asthma model. Methods Forty SD rats were randomly assigne
5、d to five groups : control group (group N) , asthma model group (group A), two pretreatment groups of different concentration of ketamine (group K1 , K2 ) and dexamethasone group(group D) with eight rats each.The rats in group A were sensitized by injection of ovalbumin (OA) together with aluminum h
6、ydroxide and Bordetella pertussis as adjuvants , followed by aerosolized OA challenge two weeks later;The rats in group K1 and K2 were sensitized with OA as group A , but exposed to aerosol of ketamine ,in which the ketamine concentrations in the nebulizer were 25 g/ L and 50 g/ L in 0.9 % sterile s
7、aline respectively;Before OVA challenge，the rats in group D were exposed to aerosol of dexamethasone .The level of NO2/NO3 in lung tissues,Activities of inducible nitric oxide synthase(iNOS) and constitute nitric oxide synthase(cNOS) were measured in all groups;and the distribution of NOS in the lun
8、g tissue in rat asthma model were observed using immunohistochemical staining.Results The level of NO2/NO3 and activities of iNOS in lung tissues in group A were signiticantly higher than those in the the other groups.Positive products in lung tissues shown by immunohistochemical method presented as
9、 brown deposit,which were mainly distributed in epithelial cells of bronchus.The iNOS activity and level of NO2/NO3 in lung tissues were highly positively correlated.Conclusions NO can induce airway hyperreactivity that worsen asthma.25 g/ L or 50 g/ L aerosolized ketamine inhalation can relieve the
10、 airway inflammation and decrease the iNOS expression in the lung tissue in rat asthma model.【Key words】Ketamine ; nitric oxide ; nitric oxide synthase; Asthma;支气管哮喘是临床上常见的气道慢性炎症性疾病，其主要的临床特征为可逆性气流阻塞和支气管高反应性(BHR)1。其中由一氧化氮合酶(NOS)诱导产生的一氧化氮(NO)是造成气道反应性增高、炎性反应加重和组织损害的重要因子之一2 。有研究表明，氯胺酮(ketamine) 对于支气管哮喘有
11、治疗作用3，且能抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性，减少NO产生4 。本研究旨在观察氯胺酮对哮喘大鼠肺组织iNOS活性及NO含量的影响。1材料和方法1.1 材料 卵白蛋白（OA,V级）购自美国Sigma公司；氢氧化铝粉剂购自上海金山化工厂；百日咳杆菌菌苗购自北京中国药品生物制品鉴定所；盐酸氯胺酮注射液(100mg/2ml)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；电子超声雾化吸入器（南京道芬电子有限公司)。iNOS多克隆抗体购自武汉博士德有限公司。1.2 动物分组及模型制备健康、普通级、成年雄性SD大鼠40只，体重160200g，由南京医科大学实验动物中心提供，随机分成生理盐水组（N组）、哮喘模型组（
12、A组）、地塞米松吸入组（D组）、25.0g/L和50.0g/L氯胺酮吸入组(分别为K1组、K2组)，每组8只。A 组大鼠用1mg卵白蛋白辅以1ml百日咳杆菌菌苗(6109/ml)和氢氧化铝160mg为佐剂注射致敏,2 周后雾化吸入1 %卵蛋白激发哮喘；氯胺酮处理组大鼠用同样方法致敏,但在激发前分别给予雾化吸入氯胺酮25 g/ L ( K1 组) 和50 g/ L ( K2组) ；D组在激发前给予雾化吸入0.01%地塞米松；N 组用生理盐水替代卵蛋白进行注射和吸入。1.3 病理切片取右下肺组织浸入10多聚甲醛溶液固定,制成石蜡切片,进行HE 染色，在光镜下观察各组大鼠肺组织炎症浸润情况。1.4
13、肺组织一氧化氮水平及一氧化氮合酶活性测定硝酸盐还原酶法测定肺组织中NO2/NO3浓度以代表NO 水平, 肺组织一氧化氮合酶活性水平采用化学比色法测定，按照试剂盒说明严格执行操作步骤，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。1.5 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)免疫组化肺组织石蜡切片,切片预处理及微波修复后,封闭非特异性抗原,加入1100 iNOS 多克隆抗体(一抗, 购自武汉博士德有限公司) , 室温下3040 min ,顺序加入生物素化羊抗兔血清(二抗) 及酶标链霉亲和素(三抗) ,二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色,脱水、透明、封片、光镜下观察阳性染色情况。结果判断：光镜下目测，分为：深棕色(
14、强阳性)，棕色(阳性)，浅棕色(弱阳性)，着色与背景相同(阴性)。1.6 统计学方法所有数值以xS表示,用SPSS11.0软件进行统计学分析，P0.05表明有统计学意义。2 结果2.1 在实验的最后阶段，取各组大鼠肺组织标本检测NO2/NO3水平。A组大鼠肺组织中NO2/NO3水平明显高于N组(P0.01)，K1组、K2组的NO2/NO3水平低于A组(P0.05)，D组的NO2/NO3水平比A组显著降低(P0.01)（见图1）。A组大鼠肺组织中iNOS活性水平明显高于N组，K1组的iNOS水平低于A组(P0.05)，K2组、D组iNOS水平明显低于A组（P0.01），K2组与D组的iNOS水平
15、无明显差异，各组肺组织中cNOS的活性水平无明显差异（见图2）。各组肺组织中iNOS的活性水平与NO2/NO3浓度水平之间有显著的相关性(r=0.551,p0.01)。各组大鼠肺组织中NO2/NO3、iNOS及cNOS活性水平比较（见表1）。2.2 大鼠肺组织病理改变(HE染色) A组肺组织切片HE染色显示支气管、血管周围大量以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润,可见支气管上皮细胞增生和脱落,肺泡腔内可见大量分泌物及坏死细胞存在(图3) ,N组切片HE染色未见上述改变（图4）。K2组肺组织无明显异常，肺泡内未见炎细胞；支气管周围无明显炎细胞细胞浸润（图5）。2.3 肺组织iNOS免疫组化染色结果光
16、镜下观察N组大鼠各级支气管、肺泡管及肺泡囊上皮细胞呈iNOS弱阳性反应,气道上皮下平滑肌呈iNOS阴性反应; A组哮喘大鼠各级支气管、肺泡管及肺泡囊上皮细胞呈iNOS强阳性反应,气道上皮下平滑肌呈iNOS阳性反应,且浸润的炎细胞也呈强阳性表达, K2组、D组大鼠各级支气管、肺泡管及肺泡囊上皮细胞呈iNOS弱阳性反应,气道上皮下平滑肌呈iNOS阴性反应(图69) 。3 讨论NO 是一个具有自由基性质的生物信息分子和效应分子,它可参与体内多种生理和病理反应过程。NO是由NOS作用下合成的。根据功能的不同，一氧化氮合酶分为两型，即原生性一氧化氮合酶（cNOS）和诱导(生)型一氧化氮合酶（iNOS），
17、前者主要调节生理功能，后者在病理状态下产生，在疾病的发生和病理过程中起着重要而复杂的作用5。在正常生理状态下，cNOS诱导产生低浓度的NO对气道平滑肌具有直接的舒张作用，气道非肾上腺能、非胆碱能神经系统以NO为介质亦可增强支气管扩张。但在哮喘状态下，过敏原及IFN-、IL-1、TNF-等细胞因子诱导肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞中iNOS 表达增加，由iNOS诱导产生大量的NO，高浓度的NO扩张支气管粘膜血管，增强毛细血管渗出，导致气道黏膜水肿，加重气道阻塞，损伤气道组织，加重炎症反应，引起气道高反应性而导致和加重哮喘发病6，7。在本实验中，和对照组大鼠相比，哮喘大鼠肺组织病理切片有明显的炎症表
18、现，进一步说明哮喘大鼠的肺部炎症可能与NO的过度产生有关。近年来的研究证实，NO这一高效而多样性的生物调节分子可直接参与细胞因子特别是与炎症有关的细胞因子的调节。此外,还可能通过NO的细胞内信号传导作用直接作用于核因子NF-B 等，影响不同细胞因子的合成8。Takano等9认为，NO可能直接参与了哮喘炎症过程的调控。因此，研究NO在细胞内信号传导过程中的作用，对于阐明哮喘气道炎症的病理机制有积极意义。哮喘时肺组织中NO2/NO3水平升高，哮喘时肺组织中产生大量iNOS使呼出气中NO水平升高，呼出气NO水平随哮喘加重而增高10，说明iNOS表达过程中产生大量NO参与哮喘气道炎症和哮喘的发病。有文
19、献报导哮喘患者用糖皮质激素可使呼出气中NO水平下降11,12，它可能主要通过抑制iNOSmRNA 的表达,减少NO 的生成，进而减少炎性介质及过氧化产物的产生，从而对损伤肺组织发挥积极有效的保护作用。本研究显示用地塞米松处理后哮喘大鼠肺组织中iNOS表达降低，同时肺组织中NO2/NO3水平也相应降低，这不仅支持NO在哮喘发病中的作用，而且对于糖皮质激素治疗哮喘的机制赋予新的含义。哮喘大鼠肺组织中cNOS活性水平变化不明显,iNOS和肺组织NO2/NO3水平呈高度正相关，提示哮喘时NO水平的升高是由于iNOS被激活、诱导所致。哮喘过程中炎性细胞亦产生IL-1、TNF-、IFN -等细胞因子，这些
20、细胞因子诱导iNOS表达其活性，致使NO大量释放发挥组织和细胞毒性作用，致气道高反应性引起和加重哮喘发病。因此，选择性抑制iNOS活性是治疗哮喘的一个方向。氯胺酮是一种常用的静脉麻醉药,它主要通过阻断N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体而发挥作用，有报道氯胺酮通过抑制谷氨酸和NMDA 受体调节的兴奋性突触传递减少NO的产生13 。NMDA受体兴奋后使Ca2+通透性增加，大量Ca2+内流，激活细胞内iNOS产生，使NO增加。氯胺酮作为NMDA受体拮抗剂，理论上可抑制NO 的产生。氯胺酮能剂量依赖性地抑制大鼠肺泡上皮和巨噬细胞内iNOS的活性和蛋白表达，抑制NO产生，起到保护肺组织的作用14。
21、对于氯胺酮是否通过NMDA受体的作用影响哮喘大鼠肺组织iNOS活性及NO含量，仍需做进一步的实验予以证实。Dickenson 等15 研究也发现氯胺酮抑制iNOS ,减少NO的产生。本研究中氯胺酮处理组大鼠肺组织iNOS 活性及NO含量显著降低，病理形态学改善进一步证实了氯胺酮可减轻大鼠肺部的炎症反应。本实验采用地塞米松雾化吸入作为与氯胺酮雾化吸入的疗效对比，探讨二者对变应性哮喘大鼠防治作用的异同。本研究发现K1、K2组和D组大鼠肺部炎症较轻，肺组织iNOS活性及NO含量均较哮喘组显著降低。结果提示，和地塞米松一样，氯胺酮对哮喘有明显的防治作用。但由于本实验观测指标较少，观察时间较短，其作用机
22、制和过程还需进一步研究。氯胺酮可抑制哮喘大鼠肺组织iNOS活性，降低NO含量，减轻大鼠肺部炎症，这可能是氯胺酮治疗哮喘的一个重要机制。对于激素治疗无效的哮喘，氯胺酮可能开辟一条新的途径。参考文献1 Amin K, Ludviksdottir D,Janson C, etal. Inflammation and structural changes in the airways of patients with atopic and nonatopic asthmaJ.Am J Respir Crit Care Med,2000,162:2295-2301.2 沈志耘,张焰 ,丁浩中等。氯胺酮对
23、急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织iNOS 活性及NO 含量的影响J. 徐州医学院学报, 2004 ,24(4):295-298.3朱美华,朱敏敏,罗巧中等. 氯胺酮雾化吸入对大鼠哮喘模型气道炎症的影响J. 南京医科大学学报,2004,24(1):46-48.4胡兴国,王钧,曾因明,等. 氯胺酮对大鼠不同脑区NOS 活性和NO 产量的影响J.临床麻醉学杂志,1999 ,15(1) :27-29.5 C Lane,D Knight,S Burgess,et al.Epithelial inducible nitric oxide synthase activity is the major deter
24、minant of nitric oxide concentration in exhaled breath J. Thorax, 2004,59:757-760.6 Coleman JW. Nitric oxide in immunity and inflammation J. Int Immunopharmacol, 2001,1(8):1397-406.7 Bernareggi M, Mitchell JA, Barnes PJ, et al.Dual action of nitric oxide on airway plasma leakageJ. Am J Respir Crit C
25、are Med, 1997,155(3):869-874.8Zhang N,Xu YJ,Zhang ZX,et al. Role of nitric oxide-nuclear factor kappaB signal pathway in functional expression of T lymphocytes from asthmatic patients J.Zhonghua Nei Ke Za Zhi,2005,44(5):328-332.9Takano H ,Lim HB , Miyabara Y, et al. Oral administration of Larginine
26、potentiates allergen-induced airway inflammation and expression of interleukin-5 in miceJ. J Pharmacol Exp Ther,1998,286 :767-771.10 Kharitonov SA,Yates DH,Robbins RA,et al.Increased nitric oxide inexhaled air of asthmatic patientsJ.Lancet,1994,343(8890):133-135.11 Dupont,Rochette,Demedts,et al.Exha
27、led nitric oxide correlates with airway hyperresponsiveness in steroid-nave patients with mild asthmaJ. Am J Respir Crit Care Med,1998,157:894-898.12 Kharitonov SA,Yates DH,Barnes PJ,et al.Inhaled glucocorticoids decrease nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients J.Am J Respir Crit Care Med,
28、 1996,153:454-457.13 Yamamura T,Harada K,Okamura A,et al.Is the site of action of ketamine anesthesia the N-methyl-D-aspartate receptorJ?Anesthesiology,1990,72(4):704-710.14 Li CY,Chou TC,Wong CS,et al.Ketamine inhibits nitric oxide synthase inLipopolyaccharide-treated rat alveolar macrophagesJ.Can
29、J Anaesthy,1997,44:989-995.15 Dickenson AH. NMDA receptor antagonists:interaction with opioidsJ.Acta Anaesthesiol Scand,1997,41:112-115.表1 各组大鼠肺组织中NO2/NO3、iNOS及cNOS活性水平比较 （xs，n8）groupNO2/NO3（umol/gprot）iNOS（U/mgprot）cNOS（U/mgprot）NAK1K2D0.4830.226* 0.8810.235 0.6380.136* 0.5960.207* 0.5430.243* 0.47
30、50.091*0.6890.0650.5840.107*0.5340.052*0.5210.069*0.5900.0460.6180.0640.6580.1470.6050.0880.6080.115与A组相比较，*P0.05,*P0.01图1. A组大鼠肺组织中NO2/NO3水平明显高于N组，K1组、K2组的NO2/NO3水平低于A组，D组的NO2/NO3水平比A组显著降低。（与N组相比较，P0.01；与A组相比较，*P0.05,*P0.01）图2. A组大鼠肺组织中iNOS活性明显高于N组， K1组的iNOS活性低于A组，K2组、D组iNOS水平明显低于A组。（与N组相比较，P0.01；与
31、A组相比较，*P0.05,*P0.01）图3. 各组肺组织中cNOS的活性无明显差异。图3 A组：支气管官腔结构不完整，腔内有 图4 N组：细、小支气管及肺泡结构正常, 大量分泌物及脱落坏死细胞（HE染色, 40） 支气管粘膜上皮完整（HE染色40,） 图5 K2组：肺组织无明显异常，支气管周围及肺间质无明显炎细胞细胞浸润（HE染色, 40）图6 N组：有少量iNOS 免疫组化阳性染色 图7 A组：有大量iNOS 免疫组化阳性染色 的支气管上皮细胞 的支气管上皮细胞 (immunohistochemical staining , 40) (immunohistochemical staining , 40) 图8 K2组：与A组相比，iNOS 免疫组化阳 图9 D组：与A组相比，iNOS 免疫组化 性染色的支气管上皮细胞大为减少 阳性染色的支气管上皮细胞显著减少(immunohistochemical staining , 40) (immunohistochemical staining , 40)