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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流感染性腹泻诊断标准(申报).精品文档.C59 WS中华人民共和国卫生行业标准 WS 2005感染性腹泻诊断标准Diagnostic criteria for infectious diarrhea（报批稿）2005 发布 2005实施中华人民共和国卫生部 发 布WS 2005前言本标准是在GB17012-1997感染性腹泻的诊断标准及处理原则的基础上制定的, GB17012-1997作废.。本标准的附录附录A是规范性附录，B是资料性附录。本标准由全国传染病标准委员会提出。本标准由中华人民共和国卫生部批准。本标准起草单位：江苏省疾病预防控制中心
2、及江苏省人民医院、南京市第二人民医院、中国疾病预防控制中心。本标准主要起草人：汪华、阚飙、方肇寅、冉陆、赵 伟、李 军、朱凤才、史智扬、顾 玲、郭喜玲、张雪峰。 WSXXX2005感染性腹泻诊断标准.范围本标准规定了除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻的诊断标准。2.术语和定义21腹泻（diarrhea）：是指每日排便3次或以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便，粘液便、脓血便或血便等。22感染性腹泻（infectious diarrhea）：指由病原微生物及其产物或寄生虫所引起的、以腹泻为主要临床特征的一组肠道传染病。引起感染性腹泻的病原体繁多，其中主要的病原及其引起的感染性腹泻病的流行
3、病学和临床特征参见附录B。3.诊断依据3.1 流行病学史全年均可发病，但具有明显季节高峰，发病高峰季节常随地区和病原体的不同而异；细菌性腹泻一般夏秋季节多发，而病毒感染性腹泻、小肠结肠炎耶尔森菌腹泻等则秋冬季节发病较多。发病者常有不洁饮食（水）和/或与腹泻病人、病原携带者、腹泻动物、带菌动物接触史，或有流行地区居住或旅行史；需排除致泻性的过敏原、化学药品暴露史及症状性、器官功能失调等非感染性腹泻病史。食（水）源性感染常为集体发病并有共进可疑食物（水）史；某些沙门菌（如鼠伤寒沙门菌）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、A组轮状病毒和柯萨奇病毒感染可在婴儿群体中引起爆发流行。3.2 临床表现3.2.1
4、 每日大便次数3次，粪便性状异常，可为稀便、水样便，粘液便、脓血便或血便，可伴有恶心、呕吐、腹痛、发热、食欲不振及全身不适。病情严重者，常并发脱水、酸中毒、电解质紊乱、休克等，甚至危及生命。3.2.2 已排除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒。3.3 实验室检查3.3.1 粪便常规检查：粪便有性状改变，常为粘液便、脓血便或血便、稀便、水样便；镜检可有多量、少量或无红、白细胞。粘液便、脓血便或血便，镜检可有多量红、白细胞，多见于沙门菌、侵袭性大肠杆菌、 肠出血性大肠杆菌、弯曲菌、耶尔森菌等细菌和某些病毒等所致的腹泻；稀便、水样便，镜检可有少量或无红、白细胞，多见于肠产毒性大肠杆菌、轮状病毒、隐孢子虫、气单
5、胞菌等所致的腹泻。3.3.2 病原体检查：从粪便、呕吐物、血等标本中检出霍乱弧菌、志贺菌、伤寒副伤寒沙门菌以外的病原体或特异性抗原、特异性核酸片段检测阳性。（详见附录A）。注：应用分子生物学方法开展病原体检测时，应遵照相关规定执行。4. 诊断原则临床诊断应综合流行病学资料、临床表现和粪便常规检查等进行。病原确诊则应依据从粪便、呕吐物、血等标本中检出病原体，或特异性抗原、特异性核酸片段检测阳性。5.诊断标准5.1临床诊断病例：应同时符合3.2、3.3.1和/或3.1。5.2 确诊病例：应同时符合临床诊断和3.3.2。6.鉴别诊断6.1霍乱 由霍乱弧菌感染所致。以剧烈腹泻起病，多数无腹痛，无里急后
6、重；呕吐多为喷射状，不伴恶心；呕吐物及腹泻物呈米泔水样，量多，少数患者有洗肉水样便。脱水严重者常引起肌肉痛性痉挛，皮肤皱瘪，体表温度低于正常。粪便悬滴镜检可发现运动极活泼的弧菌，应进一步作细菌培养，进行鉴别诊断。6.2 伤寒与副伤寒 伤寒与副伤寒甲、乙型临床表现以高热、全身毒血症状为主，可伴有腹痛，腹泻少见；副伤寒丙型可呈胃肠炎型发作，病程短，预后好，多在35天内恢复。血肥达氏反应阳性有助于伤寒诊断；血、骨髓、粪便或尿等标本中培养出伤寒或副伤寒杆菌即可确诊。6.3 细菌性痢疾 由志贺菌属感染所致。腹泻以脓血便或粘液便较为常见，量少，常有里急后重，多伴有畏寒发热。粪便镜检可发现大量脓细胞、红细胞
7、和巨噬细胞。粪便培养可检出志贺菌。婴幼儿中毒型菌痢或不典型菌痢应通过病原学诊断来鉴别。6.4 阿米巴痢疾 由溶组织内阿米巴感染所致。潜伏期数周至数月，临床表现多无发热，腹痛轻，无里急后重；腹泻每日数次，量多，为暗红色果酱样血便，有腥臭味；镜检白细胞少，红细胞多，有夏科-雷登结晶，可找到溶组织内阿米巴滋养体。6.5 非感染性腹泻 过敏性腹泻有接触过敏原史，既往有类似发作；药物性腹泻有服用致泻药物史；酶缺乏性腹泻有遗传病家族史。还有各种内外科疾病引起的症状性腹泻以及器官功能失调性腹泻等，通过详细询问病史，结合相应的检查结果进行鉴别。附录A（规范性附录）实验室诊断方法A1.沙门菌检验A1.1标本的收
8、集根椐腹泻患者的病程及临床表现等，采集相应的标本，发病第一周采血5ml，第二、三周取粪便25g或尿液1015ml,粪便挑取有脓血、粘液部分，尿液留取中段尿或无菌导尿。所采集的标本尽快检验，运送时间超过2h者，标本应放入Cary-Blair运送培养基中，在冷藏条件下送检。A1.2分离培养A1.2.1直接分离培养取新鲜粪便、呕吐物、尿液沉淀物（经3000/转离心沉淀1015min，倾去上清液）标本接种于强选择性培养基(SS、BS、WS、HE琼脂等)和弱选择性培养基（Mac、EMB琼脂）平板各一块；血标本接种于血琼脂或营养琼脂平板，3537培养1824h，从平板上挑取可疑菌落（详见表A1.2.1）进
9、行鉴定。A1.2.2增菌培养取新鲜粪便、呕吐物、尿液沉淀物0.51g接种于10ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐增菌液等；血液5ml接种于50ml葡萄糖肉汤或胆汁葡萄糖肉汤中，3537增菌68h，挑取增菌液分离培养，培养同A1.2.1。 表A1.2.2沙门菌属在选择性培养基琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板菌落特征亚硫酸铋琼脂（BS）还原亚硫酸铋菌落为黑色或墨绿色，菌落周围培养基可呈黑色有金属光泽；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变EMB琼脂无色半透明。HE琼脂WS琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株有
10、的菌落中心带黑色。Mac琼脂无色半透明。A1.3鉴定A1.3.1镜检沙门菌革兰氏染色显微镜下可见革兰氏阴性小杆菌，大小130.40.9。A1.3.2生化试验挑取可疑菌落移种于三糖铁（或KIA）和MIU上，并作氧化酶、硝酸盐、KCN、赖氨酸试验；或移种于沙门菌生化鉴定板（条）；或上微生物自动鉴定系统（仪）进行鉴定。凡生化反应符合表A1.3.2.1、表A1.3.2.2者，以沙门菌属诊断血清作玻片凝集试验。表A1.3.2.1沙门菌在三糖铁琼脂内的反应结果类型斜面底层产气硫化氢A1A2A3A4/注：表示阳性；表示阴性；/表示多数阳性少数阴性表A1.3.2.2沙门菌生化反应结果类型靛基质尿素KCN硝酸盐
11、赖氨酸硫化氢氧化酶B1B2B3/注：表示阳性；表示阴性；/表示多数阳性少数阴性A1.3.3血清凝集试验 O抗原试验 用AF多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。被AF多价O血清凝集者，依次用O4；O3、10；O7；O8；O9；O2和O11等因子血清做凝集试验。符合沙门氏菌属定义，AF“O”多价血清不凝集，送有关部门进一步鉴定。H抗原试验 先用多价H血清做凝集试验，如有一种或两种多价血清凝集，再用这种多价血清的各种H因子血清检查以确定第1相和第2相的H抗原。Vi抗原试验 用Vi因子血清检查。A1.4菌型的判定和结果报告 综合以上生化试验和血清学分型鉴定结果，判定菌型并报告结果。A2肠致
12、泻性大肠杆菌检验 A2.1标本收集 采集病人急性期、用药前新鲜粪便、呕吐物标本（5克），尽快送检。运送时间超过2h者，标本应放入CaryBlair运送培养基中，在冷藏条件下送检。A2.2分离培养取新鲜粪便、呕吐物标本分别接种于对大肠杆菌抑制性较弱的选择性鉴别培养基或其它商品化的培养基。呕吐物标本亦可先经营养肉汤于37增菌培养，待有菌生长后，挑取12接种环转种至弱选择性培养基上，37培养24小时。a）弱选择性鉴别培养基：麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂等。大肠杆菌发酵乳糖，在麦康凯琼脂呈桃红色不透明菌落；在伊红美蓝琼脂上为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带
13、或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。 b）肠出血性大肠杆菌需经mEC肉汤增菌液增菌6h，免疫磁珠捕获后，转种于 O157显色培养基和山梨醇麦康凯琼脂，肠出血性大肠杆菌O157：H7在这两种琼脂上分别为紫红色和无色菌落，部分菌株迟缓发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂上为红色菌落。 A2.3初步鉴定挑取可疑菌落作生化反应及与大肠杆菌多价血清作玻片凝集试验，阳性者用单价血清作进一步鉴定。A2.4鉴定A2.4.1肠致病性大肠杆菌（EPEC）a）标本：水样或蛋花汤样便、呕吐物；b）生化反应符合大肠杆菌特征；c）血清学鉴定符合EPEC血清型（表A2.4）。表A2.4常见肠致泻性大肠杆菌的O血清群及血清型
14、 常见肠致泻性大肠杆菌的血清群及血清型婴幼儿腹泻 成人和儿童腹泻 EPECETECEIECEHECEAECO20 O26 O44 O6:K15:H16 O8:K40:H9O28acO157:H7O9:K99O55 O86 O111O8:K25:H9 O8:H47:H-O112O26:K62:H11O101:K99O114 O119 O125 O11:H27 O15:H11O124O111O126 O127 O128O20:H- O25:K7:H42O136O142 O158O25:K98:H- O27:H7O143O27:H20 O63:H12O144O73:H45 O78:H11O152O7
15、8:H12 O85:H7O164O114:H21 O115:H511)O127:H12 O128:H7O128:H21 O139:H28O148:H28 O149:H4O159:H4 O159:H20O159:H34 O166:H27O169:H-1)无动力的变异d）PCR检测eae基因：引物对为SK1/SK2，扩增片段长度为881bp，序列如下：SK1：5-CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3，SK2：5-CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG-3PCR反应体积为50l：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X
16、-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mMdNTP；5lDNA模板；引物SK1和SK2各0.125m；补足DH2O至50l。同时设阴性和阳性对照。PCR反应程序：95预变性10min；94变性1min,52退火1min,72延伸1min,共35个循环,最后一个循环72延伸10min。电泳及结果判断：PCR产物在2.5琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为881bp判为阳性。A2.4.2肠产毒性大肠杆菌（ETEC）a）标本：霍乱样水样便、呕吐物；b）生化反应符合大肠杆菌特征；c）血清学鉴定符合ETEC血清型（表A2.4）；d）检出大肠
17、杆菌不耐热肠毒素（LT）和或耐热肠毒素（ST）。测定LT可用兔肠段结扎试验、皮肤试验、ELISA、Biken试验、平板免疫溶血试验、DNA探针杂交和聚合酶链反应（PCR）等方法；测定ST可用乳鼠灌胃试验、ELISA、PCR、DNA探针杂交等方法。PCR同时检测elt和est基因：引物对分别为LTLLTR和AL65AL125，扩增片段长度分别为322和147bp，序列如下：LTL：5-TCTCTATGTGCATACGGAGC-3LTR：5-CCATACTGATTGCCGCAAT-3AL65：5-TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3AL125：5-CCTGACTCTTCAAAAGA
18、GAAAATTAC-3PCR反应体积为50l：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mMdNTP；5lDNA模板；引物LTL和LTR各0.25m；引物AL65和AL125各0.5m；补足DH2O至50l。PCR反应程序：95预变性10min；94变性1min,52退火1min,72延伸1min,共35个循环,最后一个循环72延伸10min。电泳及结果判断：PCR产物在2.5琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为322和（或）147bp判为e
19、lt和（或）est基因阳性。B2.4.3肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）a）标本：细菌性痢疾样便、呕吐物；b）生化反应：不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，除O124外无动力，酒石酸盐阴性，赖氨酸脱羧酶阴性；c）血清学鉴定符合EIEC血清型（表A2.4）；d）豚鼠角膜结膜试验（Sereny试验）、Hela细胞侵入试验阳性、PCR或DNA探针检测侵袭基因。PCR检测ipaH基因：引物对为ipaIIIipaIV，扩增片段长度分别为619bp序列如下：ipaIII：5-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3ipaIV：5-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3PCR反应
20、体积为50l：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mMdNTP；5lDNA模板；引物ipaIII和ipaIV各0.125m；补足DH2O至50l。同时设阴性和阳性对照。PCR反应程序：95预变性10min；94变性1min,52退火1min,72延伸1min,共35个循环,最后一个循环72延伸10min。电泳及结果判断：PCR产物在2.5琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为619bp判为阳性。A2.4.4肠出血性大肠杆菌（EHEC）a）
21、标本：早期为水样便，后为血便、呕吐物；b）生化反应：不发酵或迟缓发酵山梨醇，赖氨酸、鸟氨酸、鼠李糖、蔗糖、密二糖阳性，精氨酸、苦杏仁甙阴性；c）血清型鉴定：其血清型为O157：H7（其中H7鞭毛抗原需用采用试管凝集试验法进行鉴定），O26：K62：H11、O111（表B1）；O157：H7的血清型亦可采用PCR检测O157和H7特异性基因的方法鉴定,引物序列见表A2.4.4。表A2.4.4 O157:H7特异基因检测引物序列及扩增片段长度引物名称引物序列目的基因片段大小(bp)O157-F5-TTCAAACAGAGGACCATC-3rfbO157636O157-R5-CCCAGCCACTAAG
22、TATTG-3 flicH7-F5-GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3flicH7625flicH7-R5-CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC-3O157 O抗原特异基因检测: 反应总体积为25ul，在0.5ul离心管中依次加入: 10Buffer2.5ul, 2mmol/L dNTPs 2.5ul，引物各0.5ul（10pmol/ul），Taq酶1U ，模板1ul，补足无DNA、RNA酶水至25ul，石蜡油封盖。反应程序：945min，模板DNA预变性；然后941min，631min，721min，35个循环；最后72延伸5min。每次试验均设阴、阳性对照及空白对
23、照。鞭毛抗原H7特异基因检测: 反应总体积为50ul，在0.5ul离心管中依次加入: 10Buffer 5ul, 2mmol/L dNTPs 5ul，引物各0.25ul（10pmol/ul），Taq酶1U ，补足无DNA、RNA酶水至50ul，模板1ul，石蜡油封盖。反应程序及试验对照均同O抗原特异基因检测。d）Vero细胞培养法检测VT毒素，或送上一级有条件CDC进行PCR检测VT1、VT2、eaeA和Hly毒力基因。 A2.4.5 肠集聚性粘附大肠杆菌（EAggEC）a）标本：水样便、呕吐物；b）生化反应：生化反应符合大肠杆菌特征；c）Hep-2细胞粘附试验检测细菌对细胞的集聚性粘附或PC
24、R、DNA探针技术检测特异性基因。PCR检测aggR基因：引物对为aggRks1aggRkas2，扩增片段长度分别为254bp序列如下：aggRks1：5-GTATACACAAAAGAAGGAAGC-3aggRkas2：5-ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3PCR反应体积为50l：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mMdNTP；5lDNA模板；引物aggRks1和aggRkas2各0.25m；补足DH2O至50l。同时设阴性和阳性对照。PCR反应程序：
25、95预变性10min；94变性1min,52退火1min,72延伸1min,共35个循环,最后一个循环72延伸10min。电泳及结果判断：PCR产物在2.5琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为254bp判为阳性。A2.4.6 肠致泻性大肠杆菌种间鉴别：引物对SK1/SK2、VTcom-uVTcom-d、LTLLTR、AL65AL125、ipaIIIipaIV和aggRks1aggRkas2分别检测eae、stx、elt、est、ipaH和aggR基因。详见表A2.4.6表A2.4.6多重PCR法鉴别肠致泻性大肠杆菌引物序列引物名称引物序列 目的基因片段大小 (bp)
26、SK15- CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3eae881SK25- CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG-3VTcom-u5- GAGCGAAATAATTTATATGTG-3stx518VTcom-d5- TGATGATGGCAATTCAGTAT-3AL655- TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3est147AL1255- CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3LTL5- TCTCTATGTGCATACGGAGC-3elt322LTR5- CCATACTGATTGCCGCAAT-3ipaIII5- GTTCCTTGACCGC
27、CTTTCCGATACCGTC-3ipaH619ipaIV5- GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3aggRks15- GTATACACAAAAGAAGGAAGC-3aggR254aggRkas25- ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3PCR反应体积为50l：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mMdNTP；5lDNA模板；引物SK1、SK2、ipaIII和ipaIV各0.125m；引物VTcom-u、VTcom-d、LTL、LTR、
28、aggRks1和aggRkas2各0.25m；引物AL65和AL125各0.5 M；补足DH2O至50l。同时设阴性和阳性对照。PCR反应程序：95预变性10min；94变性1min,52退火1min,72延伸1min,共35个循环,最后一个循环72延伸10min。电泳及结果判断：PCR产物在2.5琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度分别如表中所述则判相应基因为阳性。综合以上生化试验和血清学分型鉴定结果，判定菌型并报告结果。A3.副溶血性弧菌检验A3.1标本的收集急性期、用药前采集病人新鲜粪便标本25g或25ml，所采集标本尽快检查。运送时间超过2h者，标本应放入Ca
29、ry-Blair运送培养基中，室温条件下运送实验室。A3.2分离培养A3.2.1直接分离培养 取新鲜粪便接种于氯化钠蔗糖琼脂或35g/L氯化钠琼脂或TCBS琼脂等选择性培养基，3537培养1824h，从平板上挑取可疑菌落（详见表A3.2.2）做进一步鉴定。A3.2.2增菌培养 取新鲜粪便0.51g或0.51ml接种于10ml氯化钠结晶紫增菌液（副溶血性弧菌增菌液）或碱性蛋白胨水等增菌液，3537培养68h，挑取增菌液分离培养，培养同A3.2.1。副溶血弧在培养基上生长特性见表A3.2.2表A3.2.2副溶血性弧菌在选择性培养基琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板菌落特征氯化钠蔗糖琼脂因不发酵蔗糖
30、菌落近似培养基颜色，绿色或蓝绿色35g/L氯化钠琼脂菌落无色不透明TCBS琼脂因不发酵蔗糖菌落而呈绿色或蓝绿色A3.3鉴定A3.3.1镜检挑取可疑菌落涂片镜检，副溶性弧菌革兰氏染色后显微镜下可见革兰氏阴性无芽胞杆菌,细菌形态多变,有杆状、弧状、丝状及球状。不同的培养基上生长的菌体差异很大：在高盐琼脂上呈球杆状；在血琼脂上主要呈卵圆形，少数球杆状也有丝状。悬滴标本运动活泼。A3.3.2生化试验挑取可疑菌落转种三糖铁培养基并作氧化酶、耐盐生长试验，并接种蔗糖、V-P、甲基红等生化反应培养基。具体内容见表A2。A4结果报告 综合镜检和生化反应结果判断菌型并报告结果。表A2致病性弧菌鉴定表项目霍乱弧菌
31、拟态弧菌副溶血弧菌创伤弧菌溶藻弧菌辛辛那提弧菌河弧菌弗尼斯弧菌雀周鱼弧菌（少女鱼弧菌）霍利斯弧菌麦氏弧菌气单胞菌邻单胞菌最适生长温度373737373725,3537372525,36372837氧化酶+硝酸盐还原+靛基质+/-尿素酶-赖氨酸+鸟氨酸+精氨酸-葡萄糖产气-乳糖-/+麦芽糖+甘露醇+蔗糖+阿拉伯糖-纤维二糖-水杨素-明胶酶+在不同盐量肉汤中生长试验0%NaCl3%NaCl6%NaCl8%NaCl10%NaClO/129敏感性10ugSSRSRRRRSRSRR/S150ugSSSSSSSSSSSRSTCBS生长YGGG/YYYYYGG/-YA4弯曲菌检验方法A4.1标本收集于急性期
32、、用药前采集病人新鲜粪便标本10g，立即送实验室进行培养，运送时间超过2h者，应放入Cary-Blair运送培养基，4冷藏送检；或将粪便标本直接接种增菌肉汤，并置于微需氧环境下，室温条件下运送。A4.2粪便标本直接镜检急性期患者的粪便可直接作涂片检查，革兰氏染色或用0.3碱性复红单染色镜检，弯曲菌为细长、弯曲、呈S形或“海鸥展翅”状、无芽胞的革兰阴性菌。液体标本在暗视野显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性，提示弯曲菌感染。A4.3分离培养方法 A4.31培养条件本菌为微需氧菌，在6% O2, 7% CO2, 7% H2 ,80% N2条件下生长最好。可以使用混合气体法；烛缸培养
33、法；微需氧产气袋法。A4.32直接培养急性期、用药前采集的病人新鲜粪便标本可直接划线接种CCD琼脂平板（Charcoal, cefoperazone, desoxycholate agar）平板，37 oC微需氧培养2472h。A4.33增菌培养病人新鲜粪便标本5g接种弯曲菌增菌肉汤（Preston肉汤），37 oC微需氧培养2472h后划线接种CCD琼脂平板，37 oC微需氧培养2472h。 B4.34可疑菌落在培养基上的形态特征（列表形式）弯曲菌在CCD琼脂平板为灰色、湿润、沿划线生长，菌落常常不是规则圆形的。空肠弯曲菌通常为灰绿色的菌落，有金属光泽或无。结肠弯曲菌的菌落为奶油灰，湿润、突
34、起。A4.4鉴定A4.41镜检A4.4.1.1革兰氏染色镜检弯曲菌为细长、弯曲、呈S形或“海鸥展翅”状、无芽胞的革兰阴性菌。A4.4.1.2暗视野显微镜镜检液体标本在暗视野显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性。A4.42生化鉴定将可疑菌落划线接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯，37微需氧培养48h。挑取菌落做生化反应进行确证。弯曲菌的生化鉴别见表A4.4.2。表4.4.2 弯曲菌属种的生化鉴别表空肠弯曲菌Campylobacter jejuni结肠弯曲菌Campylobacter coli红嘴鸥弯曲菌Campylobacter lari过氧化氢酶试验+氧化酶试验+马尿酸盐水解试验
35、+吲哚乙酸酯水解试验+ 马尿酸盐水解试验用接种环自哥伦比亚血琼脂平板刮取菌苔，接种到0.4mL含1的马尿酸钠溶液中，振摇试管以分散培养物，置37培养2h 。然后向试管中加入0.2ml茚三酮试剂，将试管于37放置10min，出现紫蓝色者为阳性反应，无色或灰色为阴性反应。以阴性菌和阳性菌做对照。吲哚乙酸酯水解试验取50 uL含10的吲哚乙酸酯溶液，将其浸入到直径为6mm的纸片上，将纸片在空气中晾干。挑取可疑菌落生长物，将其直接涂布在纸片上，同时滴加一滴无菌蒸馏水，观察5-10min。纸片显示蓝绿色为弯曲菌反应阳性。 A4.5 菌种保存 哥伦比亚血平板37 微需氧培养48h，刮取菌苔，悬浮于含20甘
36、油的脑心肉汤， 置于70冰箱保存。复苏时，将整菌种管取出化冻并摇动均匀后，整管转种不加抗菌素的弯曲菌增菌肉汤37 培养4872h。A4.6结果报告根据A4.1、A4.2结果，报告是否检出空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。腹泻病人同时感染空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的情况很常见。A4.7培养基A4.7.1 弯曲菌增菌肉汤：A4.7.1.1 成份A组布氏肉汤Lab-Lemco 牛肉粉10 g蛋白胨10 g氯化钠5 g蒸馏水1000m LB组弯曲菌生长促进剂丙酮酸钠（Sodium pyruvate）0.25 g焦亚硫酸钠（Sodium metabisulphite）0.25 g硫酸亚铁（Ferrous sulpha
37、te）0.25 gC组抗生素多粘菌素B（Polymyxin B）5000i.u甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim）10mg利福平（Rifampicin）10mg放线菌酮（Cycloheximide）100mgD组冻融的马血（或脱纤维兔血）50mLA4.7.1.2 制法A组各组成分混合，加热溶解，校正pH值到7.00.2。装瓶，每瓶100mL。121高压灭菌15min，备用。此为布氏肉汤基础培养基。临用前，每100mL布氏肉汤基础培养基中加入冻融的马血（或脱纤维兔血）5mL、B组混合液0.5mL和C组抗生素混合液0.5mL，摇匀备用。B组混合液的制备：丙酮酸钠、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁均称取0.
38、125 g，加入2mL无菌蒸馏水，摇匀备用。C组抗生素混合液的制备：分别称取多粘菌素B 10mg、甲氧苄氨嘧啶10mg、利福平10mg和放线菌酮100mg，加入2mL的1：1丙酮和无菌蒸馏水溶液，摇匀备用。在对抗生素进行操作时安全注意事项：使用的抗生素中包含有放线菌酮，如接触到皮肤，应立即用大量肥皂水冲洗；穿适当的保护性衣服，带手套。A4.7.2 CCD琼脂A4.7.2.1 成分布氏肉汤25 gLab-Lemco 牛肉粉10g蛋白胨10g氯化钠5g微生物用碳粉4 g酪蛋白水解产物3 g脱氧胆酸钠1 g硫酸亚铁0.25 g丙酮酸钠0.25 g琼脂12 g蒸馏水1000m L头孢哌酮（Cefope
39、raone）32 mg两性霉素B（Amphotericin B）10 mgA4.7.2.2制法除抗生素外，各组成分混合，加热溶解，校正pH值到7.00.2。121高压灭菌15min，冷却至50，加入抗生素混合液0.5mL（以水为溶剂），摇匀，倾注平板。平板要密封避光保存，使用前置37过夜。操作头孢哌酮和两性霉素B要注意安全保护，穿适当的保护性衣服，带手套。 A5小肠结肠炎耶尔森菌的检验A5.1标本的收集 于急性期使用抗生素前采集粪便标本和血液等标本，立即送实验室进行检测，运送时间超过2h者，应放入Cary-Blair运送培养基，4冷藏送检。血液标本应先进行增菌。A5.2分离方法可直接接种于麦康凯培养基等选择性琼脂平皿上，26培养2448h。同时取约1g标本接种于10mL改良磷酸盐缓冲液，于4分别增菌培养7天、14天和21天后取增菌培养物转种于麦康凯平板，26培养2448h。A5.3挑选可疑菌落挑取可疑菌落，分别接种改良克氏双糖琼脂，26培养24h。将改良克氏双糖琼脂上、下两层均产酸且不产硫化氢者转种Rustigian，s尿素培养基，尿素阳性者分别转种两支半固体培养基，分别置于26和37培养24 h。26有动力且37无动力者为小肠结肠炎耶尔森菌疑似菌株，分别进行生化鉴定和血清分型。A5.4生化