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1、RNA提取方法及原理第八组一、研究背景二、方法及原理1、研究背景1.1 RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 1.2 RNA分布不同丰度不同丰度组织名称组织名称样品样品量量总总RNARNA含量含量高丰度高丰度肝脏肝脏1mg1mg2-4g2-4g脾脏脾脏1mg1mg心脏心脏1mg1mg中丰度中
2、丰度大脑大脑1mg1mg0.05-2g0.05-2g胚胎胚胎1mg1mg肾脏肾脏1mg1mg肺肺1mg1mg低丰度低丰度膀胱膀胱1mg1mg0-0.05g0-0.05g骨骨1mg1mg脂肪脂肪1mg1mg高丰度高丰度成纤细胞成纤细胞10105 50.5-1g0.5-1g人白细胞人白细胞10105 5中丰度中丰度酵母酵母10105 50.5-1.5g0.5-1.5g拟南芥叶片拟南芥叶片1mg1mg0.2-0.5g0.2-0.5g低丰度低丰度烟草叶片烟草叶片1mg1mg0.05-0.1g0.05-0.1g玉米叶片玉米叶片1mg1mg2、方法及原理2.1 RNA的提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂
3、解 3、 RNA的纯化及获得RNA提取流程 样品前处理注意点 选择新鲜血液，不得超过选择新鲜血液，不得超过4 4小时小时选择新鲜的幼嫩组织选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织选择新鲜组织，生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的然后加入一定量的TRNzolTRNzol，-70-70保存较长时间保存较长时间去掉培养基，加入一定量去掉培养基，加入一定量TRNzolTRNzol-70 -70 保存较长时间保存较长时间推荐使用推荐使用专门的专门的RNARNA样
4、品样品储存液储存液进行储存进行储存液氮或加入液氮或加入RNaseRNase抑制剂中保存，抑制剂中保存，避免反复冻融避免反复冻融RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本RNA提取流程细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍异硫氰酸胍/酚酚TRNzol总总RNA提取试剂提取试剂独特配方独特配方-RNAplant植物植物RNA提取试剂提取试剂胍盐胍盐/-巯基乙醇巯基乙醇RNAprep系列系列RNA提取试剂盒提取试剂盒RNA提取流程 RNA的纯化及获得RNA纯化要求1 1 纯化后不应存在对酶纯化后不应存在对酶( (如逆转录酶如逆转录酶) )有抑制作用物质有抑制作用物质2 2 排除有机溶剂和金属离子的污染排除有
5、机溶剂和金属离子的污染3 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4 4 排除排除DNADNA分子的污染分子的污染2.2 RNA提取的注意事项2.2.1 杜绝外源酶的污染一：严格戴好口罩，手套。 二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 2.2.2 阻止内源酶的活性 一：选择合适的匀浆方法。 二：选择合适的裂解液。 三：控制好样品的起始量。 2.2.3 明确自己的抽提目的 一：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。
6、二：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。 2.3 Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 2.4 几种RNA提取方法2.4.1 TRIzol法 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以
7、沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 TRIzol法提取流程1 样品处理： （）培养细胞：收获细胞 1-510 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min 。 （）组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置 min 。2 加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 3 4 离心， 12000g 15min ，取上清。 4 加入 0.5ml
8、 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。 5 4 离心， 12000g 10min ，弃上清。 6 加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ， 7500g 5min ，弃上清。 7. 晾干，加入适量的 DEPC H 2 O 溶解（ 65 促溶 10-15min ）。 细胞细胞基因组基因组DNA水相有机相RNA氯仿氯仿纯化纯化pH5.7离心离心加入裂解液加入裂解液(TRNzol-A+)实验流程图实验流程图细胞选择细胞选择 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞2.4.2 苯酚法 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分
9、离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。 苯酚法提取酵母苯酚法提取酵母RNA 取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4低温环境下，10000r/min 离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendor
10、f 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min 离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf 管，加2 倍体积95乙醇（含2乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。再以10 000r/min 离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。 2.4.3 异硫氰酸胍酚法 异硫氰酸胍酚法提取RNA的原理如下：GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下
11、DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。 异硫氰酸胍异硫氰酸胍酚法提取植物组织总酚法提取植物组织总RNA1） 取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加45mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。2） 置于冰上，顺序加入：50l 2mol/L NaAc , 混匀，0.5mL水饱和酚， 170l CI，混匀。置冰上15min。3） 各管平衡后，4,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，20沉淀30min-1hr或80沉淀10min。4,12 000g离心20min回收RNA。4） 用70乙醇洗一次，4，12 000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150l 异硫氰酸胍溶液，65吹打RNA沉淀溶解。5） 加等体积异丙醇20沉淀30min-1hr或80沉淀10min。4,12 000g离心20min回收RNA。6） 用70乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPCH2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于80冰箱中存放。7） 紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。 谢谢