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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流第一章第二章第三章第四章 微生物农药研发与应用.精品文档.第五章 总论也许你们不禁要问，什么是生物农药？生物农药是指含非人工合成、具有杀虫杀菌或抗病能力的生物活性物质或生物制剂，包括生物杀虫剂，杀菌剂，农用抗生素，生态农药等。现在也包含这些天然产物的一些简单衍生物，即化学修饰产物，如甲氨基阿维菌素、乙烯利等。生物农药的准确提法应该是生物源农药，早期的天然农药、植物农药、微生物农药等都归在其中。生物源农药包括植物源、动物源农药和微生物源。微生物农药是指应用生物活体及其代谢产物制成的防治作物病害、虫害、杂草的制剂。也包括生物活体的保护剂、辅助剂和
2、增效剂以及模拟某些杀虫毒素和抗生素的工合成的制剂。利用微生物防治害虫最早可追溯到100年前俄国人梅契尼可夫利用绿僵菌防治金龟子幼虫，但直到本世纪50年代“以菌治虫”的研究和生产才得到迅速发展。近30年，微生物农药在农药生产上已广泛应用，特别是在化学农药污染环境的问题日益突出的今天，微生物农药的研究和生产更加受到重视。目前，微生物农药主要包括微生物杀虫剂、农用抗生素和微生物除草剂等。微生物杀虫剂的种类很多，已发现的有2 000多种，主要包括细菌、放线菌、真菌、病毒、立克攻氏体、线虫和原生动物等。目前，国内外研究、利用的主要是细菌、真菌和病毒。第六章 病毒杀虫剂第一节 病毒杀虫剂研究与开发的现状及
3、前景病毒杀虫剂是利用昆虫病毒的生命活动来控制那些直接和间接对人类和环境造成危害的昆虫。一、 昆虫病毒的基本特性一个病毒粒子的基本结构 （核酸、衣壳蛋白、有的有囊膜），有些病毒粒子被包埋在由蛋白质晶体构成的包涵体内，称为包涵体病毒，包涵体病毒的形态多样，有呈多角形，称为多角体（所含病毒粒子从1-1000）大小约为11.5um；有呈椭圆形或圆形的，称为颗粒体（1或2个病毒粒子）大小约为0.1-0.5um。有包涵体的病毒，由于其外层的结晶排列的蛋白质对外界不良环境的抵抗力强。二、 昆虫病毒的分类早期昆虫病毒的分类主要是依据病毒有无包涵体、包涵体的形态、病毒粒子的形态和结构，在寄主的何种组织内发育等。
4、依据这些特点，将昆虫病毒分为5类：核型多角体病毒，多角体于细胞核内形成质型多角体病毒，多角体于细胞质内形成颗粒体病毒，包涵体存在于细胞核或细胞质内昆虫痘病毒非包涵体病毒（P4）三、 感染途径1、取食感染；2、经皮肤感染四、 病毒杀虫剂的生产工艺（以棉铃虫核型多角体病毒制剂为例）1、 棉铃虫幼虫的饲养繁殖；2、以人工方法使棉铃虫幼虫感染病毒；3、收集多角体；4、加工配制一定剂型的制剂。五、 病毒杀虫剂的优点1、 宿主特异性高，能杀灭害虫而不影响害虫的天敌；2、 不会污染环境；3、 后效作用明显；4、 昆虫病毒制剂生产容易、使用方便、成本低廉、适于推广。六、 病毒杀虫剂的缺点1. 杀虫范围太窄2.
5、 生产困难3. 作用速度较慢七、 病毒杀虫剂在害虫防治上的应用我国至1990年已从188种昆虫中分离到220多株病毒，其中110株为我国首次分离获得迄今，在世界各国至步有6O多种病毒进人大田进行防治农林害虫的试验，3O多种病毒杀虫剂进行了登记、注册和生产应用目前研究较多、应用较广的是核型多角体病毒(NPV)、颗粒体病毒(GV)和质型多角体病毒(CPV)我国迄今已有20种病毒进人大田试验。如斜纹夜蛾NPV、油桐尺蠖NPV（又名大尺蠖，茶树的一种致病昆虫）、松毛虫CPV均属“七五中试生产研究内容，棉铃虫NPV杀虫剂已进人批量生产，其他的如茶毛虫NPV、茶小卷叶蛾GV、草原毛虫NPV、茶蚕GV等相继
6、进人大田试验由于病毒杀虫剂具有致病力强、专一性强、抗逆性强和生产简便等优点，发展前景十分广阔，但也还存在着许多问题，如病毒的工业化生产还有困难，病毒多角体在紫外光及日光下易失活等，这都需要进一步的研究并加以解决。注：松毛虫培养在采用林间围栏的方式进行培养时，受地域、温度、季节等的因素而影响产量。八、 现阶段，病毒杀虫剂的研究方向1、 昆虫病毒蛋白质祖学和功能基因组学。2、 昆虫病毒的进化生物学研究。3、 昆虫杆状病毒表达载体系统研究。4、 基因工程病毒杀虫剂的构建。通过从基因方面入手，实现病毒杀虫剂的工业化生产，提高病毒杀虫剂的产量和作用效果。第二节 核型多角体病毒(NPV)核型多角体病毒是昆
7、虫病毒中最常见的一种。已知可感染7个目中284种昆虫。（一） 核型多角体病毒的概述一、 核型多角体病毒的一般形态具有较大的包涵体，称为多角体，外观呈四、五、六角型、不规则型等。如粘虫病毒为六角型，家蚕病毒为十二面体。依据所包埋的病毒粒子的多少，可将核型多角体病毒分为多核衣壳核型多角体病毒（MNPV）和单核衣壳核型多角体病毒（Ac MNPV）。核型多角体的直径为0.515um，病毒粒子的直径为2070nm，长约200400nm。粒子呈杆状，核心为双股DNA。二、 核型多角体病毒的理化性质核型多角体病毒的主要成分是蛋白质，不同种的多角体所含氨基酸组分基本一致，核型多角体对于不同的化学药剂具有相当高
8、的抵抗力，不溶于水及多种有机溶剂（如乙醇、丙酮、乙醚等），不为细菌或细胞蛋白酶所分解，但若以强酸或强碱溶液处理则会溶。多角体若被食入易感虫体内，能在中肠内碱性肠液中溶解并释放出粒子。三、 昆虫感染核型多角体病毒后的表型昆虫感染核型多角体病毒后，食欲减退、行动迟缓、躯体变软、组织液化，有些昆虫会爬往枝头，所以又称为“梢头病”、“树顶病”。死后虫体腹足紧握枝头或枝叶，虫体下垂，倒挂枝条上，死虫皮肤脆弱，极易破裂，流出白色或褐色稀糊状液体。（二） 杀虫机理（自学或同学讲解）病毒杀虫剂的机理在于利用其天然存在的致病性。（三） 核型多角体病毒的改造由于野生型病毒普遍存在杀虫速度慢、效力不高等缺陷，很难进
9、行工业化生产。随着基因工程技术的发展，人们开始尝试对野生型病毒进行各种改造，以构建性能优良的重组病毒杀虫剂。1、 缺失核型多角体病毒非必需基因以增加杀虫效果2、 插入昆虫自身存在和产生的激素和酶的基因以提高杀虫速度3、 插入昆虫毒素基因和细菌毒素基因以提高杀虫速度4、 插入植物来源基因以提高杀虫速度5、 修饰病毒本身基因以扩大杀虫谱第三节 质型多角体病毒（CPV）质型多角体病毒也是包涵体病毒，这和核型多角体病毒一样，但它所含的核酸为RNA。质型多角体病毒可感染的昆虫种类仅次于NPV，我国已发现的有家蚕和赤松毛虫，马尾松毛虫质型多角体病毒。（一） 质型多角体病毒的概述一、 质型多角体病毒的一般形
10、态质型多角体外观呈四、五、六角型、不规则型等。质型多角体的直径约为0.525um，因病毒种类、感染时间长短、在细胞中形成的数量等而有很大的差异。一个多角体可包埋11000个病毒粒子。病毒粒子为正二十面体，表面有由四节管组成的突起。病毒粒子的大小在6070nm之间。二、 质型多角体病毒的理化性质质型多角体病毒不像核型多角体那样稳定，质型多角体虽不溶于水，但在水中经较长时间可被溶解。在碱液中的溶解度比核型多角体病毒的溶解度小，如以稀碳酸钠也处理能失去病毒粒子，留下不溶解的多角体呈多孔状。如溶解后，不像NPV那样留下膜。质型多角体也由蛋白质构成，除此之外还含有3%左右的硅。三、 昆虫感染质型多角体病
11、毒后的表型昆虫感染核型多角体病毒后，表现活跃，急躁，肠道硬化、肿大并呈乳白色，大便石灰色。死后不倒挂，体型缩小，头、胸、腹不呈正常比例，皮肤完好，不液化。四、 质型多角体病毒的潜育期核型多角体病毒的潜育期一般在5-7天，而质型多角体病毒的潜育期一般是7-20天，比NPV长得多。但对两种病毒来说，潜育期长短的影响因素却是相同的，一般都与昆虫的种类、昆虫的发育阶段、病毒毒力、病毒数量、和环境温度等条件有很大的关系。（二） 质型多角体病毒的研发与应用对质型多角体病毒的最初研究，我国是从家蚕的病害研究开始，现以从30种昆虫中发现了质型多角体病毒，如马尾松CPV、棉铃虫CPV等。我国利用质型多角体病毒防
12、治害虫取得了较好的效果，如山东利用赤松毛虫CPV大面积防治赤松毛虫，广东和云南等地分别利用马尾松CPV和文山松毛虫CPV来防治松毛虫都取得了满意的效果。在生产上采用直接感染宿主昆虫增殖病毒，最简便的方法是在病虫害大面积发生时将病毒喷洒在植物上，然后收集病死虫。中科院武汉病毒所彭辉银等人成功研究“生物导弹”新技术，防治松毛虫获得可喜的成绩。第四节 颗粒体病毒(GV）自从1926年法国的Paillot发现昆虫颗粒体病毒以来，至今至少有684种昆虫被描述患有颗粒体病毒病，我国已发现有颗粒体病毒的昆虫寄主有黄地老虎、小菜蛾、菜粉蝶等。GV的感染途径和传播方式是昆虫病毒学研究的主要内容之一，经卵传递、感
13、病成虫的飞迁移，寄生蜂和捕食昆虫，以及食虫鸟类的传播；GV的离体传代一直是一件困难的工作。起初，人们试图从颗粒体病毒复制的组织器官中去筛选具有感染性的细胞系，未成功。经过长期探索较多成功的体外复制离体系统大多是在胚胎来源的细胞中建立的。（一） 颗粒体病毒的概述一、 颗粒体病毒的一般形态颗粒体呈椭圆形，表面和边沿不甚整齐，中部稍凹陷，略弯曲，其大小为330500200290nm。颗粒体包含着一个杆状病毒粒子,大小为2002904555nm。二、 颗粒体病毒的理化性质不溶于水及多种有机溶剂（如乙醇、丙酮、乙醚等），遇强酸或强碱，包涵体会迅速溶解，并可使病毒粒子变性而失去侵染力。完整的颗粒体病毒在7
14、0-75间能存活10min，高温条件、紫外或其他辐射线的照射也能使完整的病毒失活。低温、干燥状态下对未提纯的颗粒体病毒保存4年以上仍有感染力。（二） 颗粒体病毒的侵染后的表型感染病虫的鳞翅目幼虫食欲不振、行动迟缓、体节肿胀，虫体腹面逐渐变色呈苍白色或乳黄色，这是由于在脂肪体中产生了大量的病毒颗粒所致；皮肤上常见斑点，体色变为黄绿色，体壁常常变软或内含物液化，死虫表皮脆软易破，流出乳黄色乳状液；死虫死时倒挂树枝，呈“八字”型，后期体色变黑。（三） 颗粒体病毒的增效蛋白（En）1、 颗粒体病毒增效蛋白的发现1959年，Tanada 实验美洲黏虫颗粒体病毒 活体 失活 致死率提高美洲黏虫核型多角体病
15、毒 活体 失活 对毒性无影响 致死率提高人们将在美洲黏虫颗粒体病毒中鉴定并纯化出一种蛋白质，并将这种蛋白质命名为增效蛋白。2、 颗粒体病毒增效蛋白的相关性质到目前为止，已通过活性生物测定发现了11种病毒中存在增效蛋白成分，这些蛋白均为糖蛋白，大小范围在38-126ku，它们均为酸性氨基酸，并且均含有金属蛋白酶-锌结合域。所有的增效蛋白之间的空间结构比较相似。3、 颗粒体病毒增效蛋白的作用机理关于颗粒体病毒增效蛋白的增效机理，学术界有几种观点，现在比较认同的观点是认为颗粒体病毒增效蛋白是破坏围食膜的一种蛋白水解酶。围食膜是无脊椎动物所特有的一种半透性膜状结构，昆虫的围食膜是由中肠细胞分泌形成的，
16、根据分泌细胞在中肠所处的位置,可将围食膜分为型和型.由于围食膜紧贴中肠内壁,包裹着食物,因此具有保护中肠上皮细胞和有助于食物消化吸收的功能。围食膜主要是由几丁质和蛋白组装而成，其中的黏蛋白IIM（通过二S键与围食膜几丁质网状基质紧密相连）是颗粒体病毒增效蛋白的作用底物。由于增效蛋白能够降解黏蛋白IIM，增加了围食膜的通透性，使病毒粒子更容易通过围食膜，从而提高了病毒的治病率。4、 增效蛋白基因工程研究今年来，人们致力于构建含有增效蛋白的重组型颗粒体病毒 ，可以有效提高杀虫效率。在构建工程菌的过程中，出现多种问题：如，加入增效蛋白基因后，重组病毒的形成数目大为减少，且形态也减小。经过工作者的努力
17、，得到了既加入了增效蛋白基因又能形成正常病毒的重组体。除此之外，人们还将增效蛋白基因加入到一些工程菌中，得到产增效蛋白的工程菌，或将增效蛋白的基因片段插入到植物基因中，得到转基因植物。（四） 颗粒体病毒的应用颗粒体病毒的应用不及NPV广泛，主要用于防治菜青虫、小菜蛾、及黄地老虎等。近年来，运用颗粒体病毒来防治虫害的效果显著。如北京林业科学院生物防治研究所经过多年研究，批量生产了杨扇舟蛾颗粒体病毒，该病毒对3龄以上的杨扇舟蛾幼虫治病力很高，从而控制了杨扇舟蛾害虫大面积发生；另外，中国新疆农业科学院微生物研究所对黄地老虎颗粒体病毒进行了20年的研究，发现使黄地老虎高频率死亡的颗粒体病毒。除了单一的
18、利用某一种颗粒体病毒来防治害虫之外，人们还将它与其它农药或多角体病毒复合使用以增加防治效果，如新疆一农科所就运用多种病毒混用来防治病害，大面积实验证明，对棉花、番茄、辣椒、豆类等作物使用后棉铃虫等鳞翅目害虫的危害率控制在5%以下，经济效果显著。第七章 细菌杀虫剂第一节 细菌杀虫剂的研究开发现状及应用前景细菌杀虫剂(Bacterial inseeticide)是利用对某些昆虫有致病或致死作用的杀虫细菌所含有的活性成分或菌体本身制成的，用于防治和杀死目标昆虫的生物杀虫制剂。杀虫细菌主要来自芽孢杆菌科(Bacteriaceae)、假单孢菌科(Pseudomonadaceae)、肠杆菌科(Entero
19、bacterlaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)和微球菌科(Micrococcaeeae)等细菌类群。与其它类型的杀虫剂比较，细菌杀虫剂有独特的作用方式和杀虫机理：通过营养体、芽孢在虫体内的繁殖以及通过产生生物活性蛋白毒素等途径来致死目标昆虫。另外，细菌杀虫剂还有如下一些特点：具有一定的特异性及选择性的杀虫作用，对人、畜及非目标昆虫安全；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢；通过发酵法生产，具相对较低的生产成本及产品登记费用；可通过生物技术途径筛选或构建综合优良性能的菌株，从而不断改善产品的性能。由于具有以上特点，细菌杀虫剂自问世以来发展较快，已成为生物农药家族
20、中的主导产品。全世界已商品化的生物农药约有30多种，到90年代初的销售额约12亿美元，其中细菌杀虫剂占90以上。目前细菌杀虫剂已发展成有一定规模的产业，全世界约有30多个国家的100多家公司共生产约150多个品种的细菌杀虫剂，已逐渐应用于蔬菜、林业、园艺、卫生害虫及农业等领域的害虫防治中。目前，对细菌杀虫剂的研究利用主要集中在几个方面：1、筛选自然界新的杀虫细菌菌株，以寻找更多、更新的杀虫资源；2、应用分子生物学原理和技术，构建杀虫谱更广、毒力更强的生防菌株；3、将杀虫基因转入到多种作物体内，形成抗虫的转基因作物。应用细菌杀虫剂防治害虫虽然取得了一定的成功，但目前在世界杀虫剂市场中以苏云金芽孢
21、杆菌杀虫剂为主的整个细菌杀虫剂的销售份额仅占极小的比例，不足1%，且在应用上主要局限在棉花、蔬菜、水果以及林业等领域的虫害防治，而在其他农作物上的使用较少。这主要是由于目前细菌杀虫剂产品还存在一些不足之处，如：杀虫谱较窄，不能对在作物内部取食的害虫起作用，在水域作用效果差；在阳光照射等环境因素的影响下，杀虫活性成分的有效期短；在土壤其他微生物的作用下容易失效等。这些方面客观上影响了细菌杀虫剂的应用范围和使用效果，同时也为细菌杀虫剂今后的改进方面提供了方向。已知的杀虫细菌约有100多种，但被研制出产品并投入使用的主要是其中的4种，即苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、
22、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)和缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)。前2种属兼性杀虫芽孢杆菌，它们既能在人工培养基上生长，亦能在昆虫体内繁殖；后2者属专性杀虫芽孢杆菌，它们一般要在昆虫寄生体内才能生长并形成有侵袭力的芽孢。另外，也有少数其它芽孢杆菌及个别无芽孢的细菌发展成产品。第二节 苏云金芽孢杆菌一、 发展历史1、 世界发展历史时间（年）事件1901石渡发现家蚕猝倒病1911德国人Berliner命名1927Mattes 地中海粉螟1938法Sporcine第一个商品制剂1953Hann
23、ay伴孢晶体1959-内毒素1970美国的HD公司 HD-11977Bti医学苏云金芽孢杆菌线虫、防病、抗癌等领域，106年，在各个学科，如生理学、昆虫学、微生物学、分子学等的共同研究下，成就了今天苏云金芽孢杆菌研究的“繁荣”，关于研究苏云金芽孢杆菌方面文章的发表全世界是数以万计。2、 中国发展历史时间（年）事件1941 蒲蛰龙 菜青虫解放初孟雨 法国1955曹骥 法国商品分离、Lab杀虫1959张履鸿（苏）刘崇乐（福建）捷克引进-玉米螟1961彭中允（苏）1965武汉、长沙生产（中国Bt城）1986“七五”公关、火炬、技改蒲蛰龙教授是中山大学第一位中国科学院院士（前称科学院学部委员），是我国
24、著名的昆虫学家，对我国的生物科学和生态农业，特别是害虫生物防治、综合防治，为农田环境的改善和农业持续发展树立典范，誉称为中国生物防治之父，为生物科学技术的发展做出了重要的贡献。刘崇乐 中国苏云金杆菌的五十年；3、 杀虫谱发展史时间（年）对象1901鳞翅目 （蝶、蛾）1977双翅目（蚊子）1980s鞘翅目（甲壳虫）、线虫1990s螨虫、原生动物1998肿瘤癌细胞随着深入的研究，发现了Bt的广泛运用。二、 形态特征及生理生化1、 形态特征(P26)周生鞭毛（无）、G+、H抗原、O抗原芽孢：石炭酸复红、孔雀绿（菌株保存方式）芽晶：芽孢抗逆，、晶体形态有菱形、圆形、方形、椭圆形、不规则形，有一个（几个
25、）毒素（能杀虫）、无毒（能抗癌）。2、 生理生化菌株对营养物质的要求不高，一般农业上的废弃物或普通的碳氮源都可用来作为培养基的组分，这使得发酵生产的成本可有所降低。碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精等；N源：牛肉膏、蛋白胨、花生粉、玉米浆、鱼粉等；无机盐：K2HPO4、MgSO4、CaCO3；主要元素有磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、微量元素有锌、硅、铁所需很少，水杂质即可满足需求，多了反而成为毒素。温度：10-40，27-32适宜，35-40生长很快，但易衰老，温度太低则生长缓慢。pH：最适值7.5；8.5或5时，不能形成芽孢，O2：好O2紫外线、抗生素及化学物（放线菌素D、氯霉素、红霉素、乳化剂）
26、对菌株都有抑制作用，这些都与普通细菌的特征相似。三、 生物活性物质1、 作用机制1) 内毒素的作用机理其毒素的作用一般通过毒害胃肠组织，因此，必须由敏感昆虫通过吞食苏云金芽孢杆菌的晶体毒素和芽孢后才能生效。它们感染的主要途径是：从口腔经食道、嗉囊而至中肠；破坏中肠后，细菌侵入体腔，使血液pH发生变化；菌体进一步繁殖后就引起幼虫败血症及全身瘫痪而致死亡。以ICP为例：感染型昆虫幼虫摄入孢子和ICPICP在碱性中肠中解离ICP被蛋白酶活化活化了的ICP和C-端区域与中肠细胞膜的专化受体不可逆结合活化的毒素的N-端区域插入到细胞膜中，肠膜中形成孔道，接下来上皮破坏，消化系统瘫痪孢子萌发，虫体患败血病
27、幼虫因饥饿或败血病死亡2) 外毒素的作用机理外毒素（是RNA聚合酶的抑制剂，在各个生化过程中与ATP起竞争作用）的毒性比内毒素要低，而且它的作用仅在昆虫蜕或变态是可以明显看到，这种毒素可杀死多种昆虫或使昆虫的幼虫发育不正常，虫体的某些部分发育残缺不全等。据推理，外毒素的杀虫机理可能是通过它对昆虫体内DNA的合成，从而影响昆虫的生长发育，使其不能蜕皮或羽化，造成昆虫的畸形或死亡。2、 活性因子（P27）胞外因子：几丁质酶、磷酸酯酶C、溶血素、VIP杀虫蛋白、双效菌素、苏云金素。胞内因子：杀虫晶体蛋白、免疫抑制因子A、肠毒素，活芽孢。1) 几丁质酶几丁质酶是最早从苏云金芽孢杆菌中发现的可溶性胞外蛋
28、白类杀虫活性物质。几丁质酶单独作用时对昆虫的杀毒活力并不高，与晶体蛋白结合，降低昆虫中肠细胞对杀虫晶体蛋白的抵抗力，然后杀虫晶体蛋白进一步作用形成中肠膜穿孔，从而导致昆虫的死亡。2) 磷酸酯酶C磷酸酯酶C对昆虫肠道均有破坏作用，有助于细菌侵入血腔并繁殖。但对人体和动物细胞有一定的杀伤作用，因此限定了磷酸酯酶C的杀虫应用价值。3) VIP杀虫蛋白（从对数期开始分泌，直到稳定前期达到最高峰）是种广谱杀虫剂，它通过与敏感昆虫中肠上皮细胞受体结合，是中肠溃烂而产生昆虫致死现象。4) 杀虫晶体蛋白（ICP）ICP是苏云金芽孢杆菌制剂的主要杀虫活性成分，又叫内毒素或伴胞晶体，它的基因大多数位于质粒上，少数
29、存在与染色体上，一个质粒常常携带一个到多个ICP基因。自从1981年Schnepf克隆第一个ICP基因以来，新杀虫剂晶体蛋白基因不断地被发现、克隆并得到应用。截止到2006年，这些基因按核苷酸序列的同源性已被分为53类，373种，其中cry基因349种；cyt基因24种。这些基因的命名规则为：分别用阿拉伯数字、大写英文字母、小写英文字母和阿拉伯数字来表示，并在前面加上cry后均为斜体书写，如：cry1Ac10 。现有的ICP对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等10个目的节肢动物门昆虫具有不同程度的生物活性； 5) 芽孢芽孢是苏云金芽孢杆菌生长到一定阶段形成的特殊的休眠体结构，芽孢的外层芽孢衣富含二硫键，
30、可抵抗溶菌酶的消化，起保护作用。已发现对鳞翅目幼虫有毒性的芽孢类型有活芽孢、死芽孢、芽孢衣和芽孢外套。单独的芽孢毒力很低，需要有杀虫剂体蛋白协同作用3、 活性谱苏云金芽孢杆菌的杀虫活性谱非常广，现已发现至少有节肢动物门10个目和原生动物门、扁形动物门、线形动物门等有害生物具有毒杀活性。杀蚊子基因：cry4A、cry4B、cylLA，这些是77年以后发现的一系列杀蚊子的基因；杀线虫和原虫基因：cry5、cry6、cry7、 cry8，目前中国的南开大学从800多株菌中发现了8株株菌有杀线虫活性，特别是对松、蚕的线虫很有效；因此，这成为我国未来的研究课题；很多的基因运用于转基因植物，并且相当的成功
31、。抗虫棉，中国是即美国以后第二个具有知识产权的产抗虫棉国家，我们将基因转到棉花上，通过棉花杀死棉铃虫，从而使原来由于棉铃虫而引起的经济损失大大减少；除此之外，Bt抗虫基因还被转基因到玉米、林业等植物基因中，从而起到防治害虫的作用。四、 分类鉴定及命名1、 鉴定及分类 生理生化：碳源、氮源、酶、代谢物（共23个指标） 酯酶电泳（看电泳图谱） H抗原 PCR前三种是20年前的方法，前两种缺陷：不同亚种的生理生化指标可能是相同的，而同一亚种的反而不同，这造成了一个假象。PCR技术的发明人一般公认为是Mullis,他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由
32、高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成： 即在高温（95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（3755）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，
33、经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。鉴定从形态、生理生化指标、免疫学、分子生物学等方面进行。五、 菌种选育（1） 高毒力（2） 良好的发酵和生产性能（产量高、耗能低）（3） 对原材料的要求（4） 生产稳定性（5） 退化手段：现有菌株育种技术可湿性粉剂喷雾干燥含晶体及芽孢的浓缩液体填充罐板框过滤液体深层发酵工艺流程砂土管菌种斜面种子罐无菌空气培养基发酵液调浆罐滤饼菌浆加展着剂粉剂烘干粉碎弃去滤液加轻质碳酸钙乳剂液剂展着剂、粘着剂、防腐剂六、 生产1、 液体深层发酵1) 生产工艺流程2) 工艺条件a. 砂土管菌种b. 茄瓶斜面菌种将砂土管内的菌种移接
34、到牛肉膏蛋白胨培养基的茄瓶斜面上，在2830中培养23天，使芽孢从休眠状态活化，并取得制备种子用的菌体。茄瓶斜面菌种必须保证纯度，经涂片镜检，有95%以上的菌体的芽孢和晶体已脱落，且形态正常。c. 种子罐培养接种与培养：在无菌条件下，将30mL无菌水加入茄瓶斜面菌种中，制成菌悬液，再将菌悬液转入灭菌的血清瓶。在酒精灯火焰下，以减压接种法将血清瓶悬液吸入种子灌，然后进行发酵。经68h，营养体生长至对数期，检查无菌即为合格种子。d. 发酵罐培养发酵罐培养是细菌大量繁殖并形成晶体和芽孢的阶段，种子质量、发酵培养基成分和发酵条件是影响这阶段产量的重量因素。发酵条件及管理：培养温度控制在301,整个发酵
35、过程应定时取样检查，测定糖、碳、氮、磷的含量和pH值，若有过高过低现象，须采取补料等措施加以调整。培养2022h，经检查无杂菌，有80%90%的菌体明显形成芽孢和晶体，其中有8%10%左右的芽孢和晶体已脱落，即可放出发酵液。e. 发酵液的后处理培养好的发酵液，可根据成品剂型采用不同的方法进行处理。例如，成品为粉剂或可湿性粉剂，则发酵液可按其体积加8%10%的填充剂（轻质碳酸钙），混匀后经板框过滤获得滤饼。滤饼经烘干粉碎即为粉剂；若将粉饼调浆后加入展着剂，通过喷雾干燥成为可湿性粉剂。如果成品为液剂或乳剂则将发酵液经离心或真空减压浓缩后加入乳化剂，即为乳剂；加入一定量的展着剂、粘着剂、和防腐剂，就
36、成为液剂。2、 半固体发酵1) 生产工艺流程砂土管菌种 斜面菌种 液体种子扩大培养 半固体浅盘发酵 干燥 粉碎包装2) 工艺条件a. 种子扩大培养在无菌操作条件下，每支斜面菌种加入35mL无菌水，用接种环把菌苔刮下制成菌悬液，接入种子培养液内，每瓶约接种菌悬液1mL。在2830连续振荡培养68h。b. 半固体浅盘发酵“压力脉动固态发酵反应器”接种前，两手及可能接触到培养基的用具均需用75%酒精或2%漂白粉水洗消毒。接种时，将生长正常的种子液按培养料干重的20%50%均匀地倒入培养料中充分拌匀，平铺在浅木盘上，料厚约1.53cm，上覆一层灭菌的纱布或湿报纸，以减少水分散失。发酵初期，室温应保持2
37、830，培养1020h后，料温可上升达37以上，菌量也大量的提高。此时，应降低室温或翻拌培养物以加速品温下降，使品温控制在32以内。36h后，含菌量已不再明显增长，芽孢也已逐步形成，这时可将培养料搅拌翻动12次，并适当提高室温以促进菌体迅速老熟。一般经23d，大部分菌体已形成芽孢囊，并有20%左右的芽孢、晶体脱落时，即可终止培养。一般具有豆鼓气味。如有酸馊或臭味、或变稀等现象，则产品已严重污染或完全失败。正常产品镜检时，可见大部分菌体为芽孢囊及脱落的芽孢和晶体。营养体较少，无杂菌或只有少量杂菌。c. 干燥和包装培养好的半固体培养物，除即时使用外，必须迅速进行干燥处理，可在不高于60的烘房内通气
38、干燥，也可用无色塑料薄膜架空遮盖，在干燥后产品含水量应在5%以下。粉碎后装入塑料袋或其它防潮的容器内，置阴凉干燥处保存备用。合格的成品一般每克应含有50100亿活芽孢。3、 生产中存在的问题（1） 噬菌体的危害在杀虫细菌生产过程中，噬菌体的侵染是影响产品的主要问题之一。往往使工业生产连续倒罐，有时甚至被迫停产。在发酵罐中，噬菌体的感染一般在细菌生长对数期表现最为突出，此时会出现pH上升，温度增高，镜检有长形菌体，且有畸形状如中部膨大或局部出现缺刻等。23h后，菌数骤降，甚至全部自溶。如做菌落培养则可在培养皿中出现呈透明的圆形或针点状的噬菌体斑。噬菌体来源：一、菌种本身原来就有；二、来自生产环境
39、设备安装不合理措施：一是纯化菌种，二是加强卫生管理，三是选育抗噬菌体的菌株（2） 产品的标准化毒力测定无统一标准，产品的质量不稳定，这给实验研究和防治实践都带来一些困难，甚至影响到进一步的推广应用。毒力测定方法a) 生物测定法（国际标准法）以敏感昆虫为试虫，同时测定供试样品和标准样品对昆虫的LC50值，并计算待测样品的毒力效价。试虫、地域差别、生测不同鳞翅目：混合饲食法、浸液喂法鞘翅目：无统一方法缺点：耗时长、费用大、受昆虫的虫龄、环境条件影响。b) HPLC法先用蛋白酶解晶体，酶解后的片段用HPLC分析，制成肽图c) 免疫分析法利用抗原与抗体之间高特异性反应实现对抗体、抗原或相关物质进行检测
40、的分析方法（缺点是其测得的是半孢晶体的数量，而不是实际杀虫效力，并不能区别有无毒性的半孢晶体。）d) 质谱分析法e) 电泳法（3） 提高菌剂质量和降低成本问题当前的生产工艺水平总体偏低，表现在产品质量不稳定，原料来源、生产效率和产品贮藏也都有问题，这使得这类杀虫剂的推广应用受到影响。七、 应用分子生物学a) 基因鉴定（cry）b) 克隆、表达（研究结构基因组学和功能基因组学之间的关系）c) 构建工程菌（是解决单一Bt的杀虫不过关问题，把不同的Bt基因组合在一块，甚至把其它细菌的基因也组合进去，细胞工程、基因工程）d) 转基因植物（烟草、水稻）杀虫工程菌的构建基因在土壤中不稳定，难防治土壤病害，
41、并且寿命短，需重复使用荧光假单孢菌：植物根圈和土壤中常见的有益细菌，对环境适应性强、同植物亲和性好，对人畜安全，不少菌株还防病增产。杆状病毒：将Bt与杆状病毒重组，能够解决杆状病毒杀虫慢的特性，并且能够利用杆状病毒的垂直传播的特性。（武汉大学和中山大学研究这方面）蓝细菌：Bt在野外杀蚊子的效果不如实验室，人们一般是将药物直接加入水体中，由于Bt的比重比水大，会沉入水底，从而降低效率。而蓝细菌是生活在水面，并且，蚊子幼虫很喜欢吃蓝细菌，提高药效，如今很多国家都在做这方面的研究。面临的问题1、 工程植物的安全性1) Bt杀虫晶体蛋白的抗虫谱较窄，而限制了其抗虫基因工程中的应用，虽然已分离到众多的B
42、t毒蛋白基因，其抗虫谱几乎覆盖了所有的鳞翅目害虫，但具体而言，每一种Bt毒蛋白基因的抗虫谱却十分有限，或只对某个种或某些种有抗性。2) 由于转基因植物给昆虫提供了个连续恒定的选择压，使昆虫在群体水平上产生了耐药性。Van montage博士指出：“转Bt毒蛋白基因植物如欲取得实用价值，则必须解决害虫易对其产生耐药性的问题”。转Bt毒蛋白基因植物注：a) 取食时间明显缩短，爬行、静息时间明显延长b) 3龄幼虫后期对转Bt基因棉花组织的选择顺序和特点不同于对无毒植株的选择（通常的顺序是 叶蕾花瓣幼铃；转基因的顺序是 蕾花瓣幼铃叶c) 在较低剂量下，对棉铃虫初孵幼虫产生很强的拒食作用d) 对棉铃虫1
43、龄幼虫的生长抑制及死亡率明显大于2龄、3龄3) Bt毒蛋白基因在植物体内的沉默与甲基化、转基因的拷贝数、插入受体植物位点及转基因是否与受体植物中有同源基因等有关。使其表达水平低。4) Bt毒蛋白可能成为转Bt毒蛋白基因植物最严重的生态危机。这方面的研究已成为热点，有关转基因植物对生态环境和食物安全性的影响已进行了不少研究，积累了一大批有价值的资料。但目前已商品化的转Bt杀虫晶体蛋白基因植物对生态环境产生危险性还末见报道。5) 不少文献报道了转基因植物会产生一系列性状变异。吴刚等研究发现，转cryA(b)，cryA(c)Bt毒蛋白基因的水稻株系在株高、穗长、单粒重、面粒重和结实率等方面都显著降低
44、，而单株有效分数增多，生育进程推迟，落粒性增强。所以, 选择优质表型且具较强杀虫作用的转基因植物，对于创造优良性状的抗虫植物至关重要。2、 基因的定位表达（如植物，我们希望它在叶片表达，而其在根部表达）3、 昆虫的抗性注昆虫产生抗性的机理：a) Bt毒素的溶解性： 原毒素晶状体的不完全溶解或转基因作物表达产生的一些不溶解的毒素的混合物b) 毒素与细胞膜上受体的结合（Bt的受体氨基肽酶N特异性结合）竞争性抑制作用一级结构的改变二级结构的饰变c) 细胞膜上孔洞的形成 形成受阻及孔洞的阻塞d) 中肠上皮的缺失修复作用 针对毒素剂量较低或转基因作物中毒素的表达量较低e) 行为机理 停食反应（实夜蛾属昆
45、虫的幼虫能区分含有毒素的饲料）4、 施用时的缺点注：a) Bt是一种胃毒剂，害虫吃了才有效，因此施药时要喷洒均匀b) 只对植物体表的未成年阶段有效，因而对钻蛀到植物体内的昆虫没有什么效果c) 缺乏传播扩散工具，只能象化学药剂一样施用d) 不会引发害虫流行病，除非在封闭的或拥挤的环境中如蜂巢、养虫室或储粮箱内e) 药效短，施药比化学药剂频繁，光照下易分解，大多数剂型在叶面的效果不到一周，有的菌系药效期不到一天。f) 专化性强，当几种害虫同时发生时对不感染性害虫不能兼治g) 储藏期短，要在干冷、无阳光直射的环境中储藏时间最长第八章 真菌杀虫剂第一节 总论真菌杀虫剂的两个优点：许多分离菌具有较宽的寄
46、主范围通过角质层侵染来感染寄主。1、 杀虫真菌制剂美国环保署批准EcoScience绿僵菌产品Bio-Path、Bio-Blast用于防治蟑螂、白蚁2、 植病生防真菌制剂欧美多家公司已经登记注册了Rootshield等9种导致植物病害的木霉生物防治制剂。3、 真菌除草剂像Casst（美国）等产品可用于防治旱地杂草。ABG5003（美国）和轮枝菌可用于防治水花生等外来杂草。一、 真菌农药的发展趋势真菌农药在植物病虫草害的持续控制中具有巨大潜力，近年来对这方面的研究已成为生防制剂研究的热点。1、 高效菌株选育研究真菌的杀虫抑菌机理，研究真菌侵染治病的相关功能基因，有目的地进行菌株选育和改造，不断培育高毒力、高生产力、适合各种不同对象、不同环境使用的优良生防菌株。2、 发酵生产工艺的改进3、 农药制剂的研究真菌生防制剂应用范围受到限制的一个重要影响因素是真菌制剂作用慢、效果不够稳定、产品货架期短，剂型优化研究可以在很大程度上改进或克服这些缺陷。例如，添加抗紫外线剂、稳定剂、等助剂第二节 绿僵菌绿僵菌是最早用于防治害虫的一种有效的杀虫真菌，利用它来防治害虫的研究与实践已愈百年。从防治规模看，绿僵菌已发展成为仅次于白僵菌的真菌杀虫剂。一、