微生物学及检验技术.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物学及检验技术.精品文档.第一章 卫生检验综合知识“中华人民共和国计量法”是1985.9.6由中华人民共和国第二十八号主席令公布的，自1986.7.1起施行。计量法中有关的条文有：第五条：国务院计量行政部门负责建立各种计量基准器具，作为统一全国量值的最高依据。第八条：企业、事业单位根据需要，可以建立本单位使用的计量标准器具，其各项最高计量标准器具经有关人民政府计量行政部门主持考核合格后使用。第二十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门对其计量检定、测试的能力和可靠性考核合格。计量法实施细则：1987

2、年国家计量局发布的“中华人民共和国计量法实施细则”其中： 第三十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门计量认证。计量认证：本规范经国家技术监督局于1990年7月20日批准，并自1990年11月1日起施行。卫生部于1981年发布的卫生标准管理办法第一条规定：卫生标准是国家的一项重要的技术法规，是进行预防性和经常性卫生监督的重要依据。卫生标准可分为：强制性标准和推荐性标准；又分为国家标准、行业标准、地方标准和企业标准。 国家标准以“GB”表示，国家推荐性标准以“GB/T”表示；卫生部发布的卫生行业标准以“WS”表示，推荐性标准表示为“WS /T”。卫生标准制

3、定状况：建国后最早颁发的卫生标准是在1953年；正式列入国家标准编号的第一个卫生标准是1956年颁发的“工业企业设计暂行” 卫生标准；到1996年底，我国已有卫生国家标准1200项，到2004年止，与劳动卫生标准配套的标准方法已有249多个；与环境卫生标准配套的居民区大气标准方法已有20多个；与食品卫生标准配套的标准方法，其中理化检验方法已有70多个，微生物学检验方法已有30多项。我国的卫生标准由“全国卫生标准技术委员会”及其专业委员会负责制定和评审，又国家质量技术监督局和卫生部审批。中华人民共和国传染病防治法：1989年2月21日第七届全国人民代表大会常务委员会第六次会议通过。2004年8月

4、28日第十届全国人民代表大会常务委员会第十一次会议修订。中华人民共和国传染病防治法：共79条 本法自2004年12月1日起施行。传染性非典性肺炎：（简称为非典性肺炎，AP）是指2002年11月起，我国局部地区发生的、主要以近距离空气飞沫和密切接触传播为主的呼吸道传染病，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。 世界卫生组织于2003年4月16日，在13个WHO网络会议上宣布一种新的冠状病毒是DNASARS的病毒，从而为SARS防止提供了依据。第三章 医学分子生物学 （一）、病毒的概念：病毒是一类体积微小、结构简单、具有严格的寄生于活细胞的微小生物，它们具有下列几种基本特征： 1、病毒

5、的基本结构是由核酸（基因组）与蛋白质组成，由DNA或RNA组成核心，外有一蛋白外壳（核壳），有些病毒在核壳外面另有一层脂蛋白组成的包膜包围着。 2、病毒只在活细胞中增殖，因为病毒缺乏完整细胞器等必要装置，所以必须依赖宿主细胞提供高分子合成装置和能量。 3、病毒非常微小，无细胞结构，绝大多数不能用光学显微镜检查，而必须用电子显微镜才能察见。第一节核酸基本知识：一、核酸化学：DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。RNA与DNA差别在核糖2，位带有一个羟基。DNA DNA起储存遗传信息作用，并以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。由4种核苷酸组成DNA分子，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。在动植物、细菌、真菌

6、中都含有DNA，但在病毒中（非细胞型微生物）不一定含DNA。DNA为长丝状分子互相纠缠（jiuchan），其溶液十分粘稠。它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电核，DNA变性后OD值会升高。因DNA 不溶于乙醇，常用二倍量沉淀DNA 在变性温度时，它的粘性突然降低。 淬火是为了保持DNA单链状态。DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动恢复双螺旋结构。说法错误的：（1）DNA和RNA的化学结构碱基G与C通过2对氢键配对构成DNA分子说法错误的。 （2）与DNA分子相比，RNA分子难水解的看法也不对。（3）许多质粒可在宿主之间进行转移的说法是不对的。（

7、注意）形状： （1）tRNA二级结构呈三叶草形。（2）在细胞内RNA分子中rRNA占比例最大。（3）DNA二级结构中呈左手双螺旋的是Z构象。DNA结构、性质：在真菌中网崎片段一般为100200核苷酸。噬菌体核酸最常见的是双链线状DNA。反式作用因子具有的DNA识别或DNA结合域，主要有 螺旋/转折/螺旋（T/H/T）,锌指结构，碱性-亮氨酸拉链（bZIP），碱性-螺旋/环/螺旋（bH/L/H）。真核生物中的端粒酶是由RNA和蛋白质构成的。一般真核生物染色体上有5种主要的组蛋白，其中亲和力最强的两种是H3 H4 。二、DNA的复制和修复：（1）细胞每分裂一次，染色体DNA就合成一次，新DNA是按

8、原DNA分子合成。（2）DNA分子拆（ca）开成两条链，依每一条单链合成一条新单链，成为半保留复制。（3）在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。（4）DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。（5）在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3，末端的羟基上。（6）在合成发生错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。（7）在人工合成DNA时，只加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么合成就会停止在缺失的核苷酸位置上。在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶。DNA三个终止密码子分

9、别是UAA、UAG、UGA。在大肠菌中DNA复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶。该酶的核心聚合酶中，具有3， - 5，外切酶活性的亚基是亚基。在体内染色DNA复制时必须有RNA引物。在哺乳动物细胞中负责合成线粒体DNA是DNA聚合酶r。RNA酶Tl可特异地作用于嘌呤核苷酸3，端磷酸并切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键。体内DNA复制与体外PCR不同的是引发酶参与。与体内DNA复制不相关酶是反转录酶。在细胞内DNA合成正常进行是RecA蛋白，而RecA蛋白不具有蛋白酶活性。在大肠菌DNA聚合酶 klenow片段没有5， - 3，外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶 糖基酶系统不包括Sl核酸酶。在

10、逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。在逆转录酶的最终产物双链DNA的长度较正链RNA稍长。三、转录：在生物体内，RNA合成过程称为转录。它（RNA）是按照储存在DNA上遗传信息合成。合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 去掉RNA分子5，末端的磷酸，不起合成酶功能的作用。在刺激点突变，改变某些基因功能与DNA向RNA转移无直接关系（？）（1） 大肠菌的RNA聚合酶由5个亚基，其亚基有启动子作用。（2） 利福平作用该酶（聚合酶）亚基上。（3） RNA聚合酶主要是转录rRNA（构成核糖体骨架的是rRNA）。 Prt-mRNA内含子的5，- 末端一般是GU。（4）

11、 RNA聚合酶主要是转录hnRNA。在真核基因启动子近侧序列元件中，对转录起点定位起关键作用的是TATA盒。（5） 放线菌素D能抑制DNA转录。编码核糖体RNA的基因是一种中度重复序列的DNA序列。四、翻译：在合成各种不同RNA中：（1） tRNA具有搬运氨基酸功能。构成核糖体骨架的是rRNA。 mRNA直接决定蛋白质的结构。（2） 合成蛋白质需4种核苷酸，排列组成遗传信息，然后转换成20种氨基酸，组成遗传信息称为翻译。（3） 3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种。（4） 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。（5） 在核糖

12、体上，有两个位置上暴露出mRNA（直接决定蛋白质的结构）分子相邻的两个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何一种氨基酸tRNA（具有搬运功能）与其对应，这说明合成蛋白质结束，并已开始同一种蛋白质分子的合成。（6） 合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就能自动折叠卷曲成一定的空间形状。（7） 在原核生物核糖体是由16 SrRNA、23 SrRNA、5 SrRNA 组成，在真核生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。五、基因表达调空：（1）氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。 （2）在基因5，上游基因内或其3，下游序列中存在，能提高同一条DNA链

13、上靶基因转录速率的遗传控制元件是增强子。 （3）乳糖操纵子中结构基因是LacA、LacY、LacZ。六、遗传重组：转座子的功能有（1）促进染色体重排，（2）促进基因重复，（3）促进基因扩增，（4）造成缺失突变。在大肠遗传重组中，同源重组需RecA蛋白质。第二节实验技术：一、核酸提取、纯化、浓缩用煮沸法从表达内切酶A的大肠菌小量制备质粒时不能省略酚-氯仿抽提。用煮沸法制备质粒所用溶菌酶液是用TrisCL配制的。 用乙醇沉淀溶于SDS中RNA时，要避免用乙酸钾。小量制备DNA时不被限制酶切开，应用酚-氯仿抽提。用异丙醇沉淀核酸与用乙醇相比，最明显优点是可减少溶液体积。1、质粒DNA提取：在用碱裂解

14、法少量提取质粒DNA时，在缓冲液（液）中不含SDS。多数质粒在自然状态下是环状链DNA。 质粒DNA纯化方法有：离子交换层析；聚乙二醇分级沉淀；二凝胶过滤层析；氯化铯（se）- 溴化乙锭梯度平衡离心。 质粒具备有复制起点、抗生素抗性基因、有多种限制酶的单一切点、有较高的拷贝数。2、NA凝胶电泳：要使大于2Kb的DNA片段在凝胶电泳中分辨率达最大，其电压不应超过5V/cm。在电泳中不同构象DNA泳动率通常是：超螺旋线性切口环状。二、PCR扩增技术：PCR反应中变性、延伸温度通常是：95、72。引物的Tm值估算每个A或T加2。 在PCR反应中每一种dNTP的浓度通常是200umol/L，在PCR反

15、应中经n次循环后理论上，DNA链的扩增数目是2n倍。 在PCR反应中引物只与靶序列的相应部分结合的说法是错误的。再此（PCR扩增技术）反应中矿物油不是必需的，用于扩增未知序列的PCR是反向PCR。 不对称PCR法专用于制备单链DNA的扩增。 在PCR反应DNA碱基错配率较高，原因是TaqDNA聚合酶缺乏3， - 5，外切酶活性。 PCR反应中的引物是DNA。反应体系中Taq酶过多及引物过多都可引起非靶序列扩增。三、寡核苷酸探针合成、放射标记、杂交标记合成寡核苷酸时dNTP的浓度不应低于1umol/L。探针是一段带标记的单链DNA，双链DNA，cDNA，单链RNA。杂交液的成分与杂交温度间的关系

16、正确的是甲酰胺42，水68。标记探针的最有效简单方法是体外转录法。标记双链DNA的3，端时，常用T4噬菌体DNA聚合酶，而不是大肠菌DNA聚合酶klenow片段，主要是因为3，- 5，外切酶活性高。Western blotting所用探针一般是Ab。Southen blotting一般是用于DNA分子的杂交技术。在核酸分子杂交技术基础之上又发展了一系列检测DNA和RNA的技术，如Southen blotting、Western blotting、Dot blotting和菌落杂交。大肠菌的DNA聚合酶用在切口平移法标记DNA。在2025下探针与靶序列退火速率最大，比解链温度低情况下进行杂交。将

17、外源性质粒导入细菌中称为转化。外源性重组质粒与感受态细菌混在一起，一般在42作短暂的热刺激。cDNA基因克隆以mRNA为模板。四、基因克隆载体：柯(ke)斯质粒载体具有噬菌体特性，能通过溶菌周期，形成子代噬菌体颗粒的说法是不对的。五、DNA序列测定：与Sanger双脱氧链终止DNA测序法相比，Maxam-Gilbert法所测序列为原DNA分子，这是其特点。六、克隆子DNA定点诱变：Mu噬菌体DNA转座成分不含末端反向重复序列。 改变蛋白质密码序列的个别密码子最好采用寡核苷酸介导诱变。七、研究DNA与蛋白质的方法：（1）凝胶阻滞试验（2）DhAsel足迹试验、（3）甲基化干扰试验、（4）体内足迹

18、试验都是研究DNA与蛋白质作用的方法。第四章 免疫血清学知识第一节：血清学：一、基础知识：1、Ag-Ab反应结合力： 有4种力致使Ag-Ab结合，其中一以静电引力为最重要。2、Ag-Ab反应特点（1）特异性、（2）阶段性（两个阶段）、（3）可逆性、（5）比例性（Ag与Ab结合比例以3：2为最佳）（Ag=3，Ab=2）。3、影响Ag-Ab反应的因素：（1）温度（多数情况下反应适宜温度为37）、（2）PH值（一般反应适宜PH值68）、 （3）电解质（多用0.85%盐水）。当温度升高反应加快，电解质浓度加大时反应敏感性升高，无电解质时Ag与Ab基本上不反应。参加反应的Ag也有影响，Ag浓度超出适宜量

19、使反应的敏感性下降，过量的Ab会使反应出现前滞现象。（4）血清交叉反应：出现血清交叉反应是说明有共同抗原存在。 二、血清检验技术：1、血清凝集反应：采用颗粒状Ag（死菌或活菌，多用死菌）进行的血清反应。玻片凝集是其中一种，有许多优点，最重要的优点是报告结果快，多用于快速诊断。试管凝集是最多用的一种方法，从温箱中放24小时后取出反应管在室温放2个少时再判定为宜，判定凝集滴度以凝集程度为（+ + ）而定。协同凝集用SPA（葡萄球菌A蛋白）与IgG的Fc结合后进行的凝集反应。SPA与IgG结合具有种属性，（容）易与兔血清中的IgG结合。用此试验主要查Ag。 2、抗球蛋白试验：是用检查不完全Ab（半A

20、b），在试验中所用第二Ab是双价抗体。基本方法是以试管凝集试验为基础。 3、沉淀反应：其中包括环状反应、絮状反应、琼脂扩散反应等。沉淀反应是用可溶性Ag。Ag-Ab沉淀反应用的电泳是琼脂电泳和对流电泳。环状沉淀反应的沉淀环是在Ag与Ab两液面交界处形成，判定时间是37分钟（环状沉淀反应）。用琼脂扩散反应做Ag分析时，其反应温度在46下进行为宜，一般是72小时后判定结果。（琼脂扩散反应）用其进行诊断时多在1822下进行，琼脂浓度多在1%2%。4、电泳： 用电泳做诊断多为琼脂电泳和对流电泳。这类电泳反应本质属于Ag-Ab沉淀反应。5、CFT（补体）： 参与CFT有两个反应系统 5种成分参加 。其中

21、补体（CFT用的补体是豚tun鼠血清中补体）是此反应的纽带。它（CFT）与两个系统的结合是非特异性的。在CFT中用豚鼠血清中补体，常用灭活温度是56 30分钟，不同动物的血清补体灭活温度是不同的。CFT又分为温CFT、冷CFT。温CFT：是指反应温度37 30分钟，主要是查IgG类Ab。反应管出现不溶血现象是阳性反应。补体是多为1：15-1：20稀释度。冷CFT：是在46（琼脂扩散反应做Ag分析时温度也是46）进行此反应多用于查Ag。此外，补体（CFT）还参与溶血反应和溶菌反应。第二节免疫学基础：一、 抗原（Ag）：Ag是指能够刺激机体产生免疫应答（产生Ab、细胞免疫等）物质。 完全Ag是指既

22、有免疫原性又有反应原性的物质，而只有反应原性无免疫原性的物质称为半抗原。 决定Ag特异性的最小化学亚单位称为决定基（蔟cu），又称为表位。依其与胸腺的关系又分Ti抗原和TD抗原。 Ti抗原刺激机体产生IgM抗体，TD抗原产生需有T细胞辅助。 蛋白质是抗原性最强的物质，其次是多糖、核酸、类脂是抗原性最弱物质。 人类血型抗原有A和B抗原，它们（A抗原和B抗原）刺激机体产生抗A和抗B抗体。人类血型抗原是同种异型抗原（同一种属不同个体间的遗传标记不同）。器官移植所产生的排异反应。也是因同种异型抗原所致。 佐剂在免疫中常常采用，它主要的机制是增强机体对Ag的免疫应答。二、 抗体（Ab）：Ag物质刺激机体

23、产生Ab，Ab本质是Ig（免疫球蛋白）。Ig（免疫球蛋白）分为五大类：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。 Ig（免疫球蛋白）的基本结构是：四条肽链（2条轻链-L链，2条重链-H链），由二硫键连接。 L链（轻链）：可分为 可变部分（V）和恒定部分（C），即 V（可变部分）L（轻链）+ C（恒定部分）L（轻链）即VL + CL。 H链（重链）：也分可变部分（V）和恒定部分（C），即VH + CH，但CH（恒定部分、重链）部分又分为CH1、CH2、CH3。IgM和IgE还有CH4部分。CH1与CH2区 之间为绞链区。如果用木瓜酶水解后，将IgG水解2Fab和Fc。Fab是Ig与Ag结合部位，F

24、c是可结晶部分。用胃蛋白酶水解IgG，可分为F(ab,)2和Fc部分，F(ab,)2是2个Fab连在一起的部分。Ig（免疫球蛋白）的分类是根据H链（重链）结构特点，主要依Fc部分（CH）。Ig同种型是指H链所具有的特性。Ig（免疫球蛋白）分型是依据L链（轻链）结构特点，可分为和型。Ig的Fc段部分可与某些细胞的Fc受体结合，如巨噬细胞。 F(ab,)2部分是与Ag结合部 ，VH （重链）+ VL（V可变部分L轻链）是F(ab,)2中的高变区，直接与Ag能结合的部位。人类5种Ig（免疫球蛋白）各具特色：IgG-血清中含量最高；IgM-分子量最大；IgG：在血清中含量最高；它还是唯一能通过人类胎盘

25、的；IgG是抗感染的主要Ig(IgG抗病毒抗体)；结合补体；起到条理作用；结合SPA（葡萄球菌A蛋白）；起到沉淀反应；中和反应；溶解细菌。H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体；肥达试验IgG类H抗体出现较晚；IgG是人血清中的主要抗体 IgG是固定补体IgM、分子量最大；早期多为IgM（IgM早期诊断）；IgM是种属发育过程中最原始的Ig（早期出现抗体的是IgM）；IgM有很高的结合价和凝集能力。IgM是动物机体在受到初次抗原刺激后最早产生的一种抗体球蛋白。Ti抗原刺激机体产生IgM类抗体。肥达试验IgM类抗体出现较早。 IgM是感染早期出现的抗体IgA、有分泌型存在；局部Ab；IgA抗蛋白酶的

26、水解作用。IgA对大肠杆菌有一定抑制作用；其含量仅次于IgG。呼吸系统的非特异性防御机制机械物理性防御富含IgAIgE、与肥大细胞膜上Fc受体结合（结合肥大细胞）；是血清中含量最少的一类Ig；IgD。在血清中含量很少；因其性质很不稳定、半衰期很短，所以对其了解尚少。三、 补体（C）：补体是存在于人和动物血清中，即可参加特异免疫又可参与非特异免疫 作用的大分子物质。它有9种成分，11种蛋白组成。 9种成分是：C1（q.r.s）、C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9。它们对温度很敏感，易破坏。 补体系统包括补体及D、P、B等因子组成，约有20种成分。补体的激活有两个途径：（1）传统途径（

27、第一途径）和旁路（第二途径）。（1） 传统途径（第一途径）：可被Ag-Ab免疫复合物（IC）活化。活化顺序是：C1、C4、C2、C3、C5 C6 C7 C8 C9。四、 免疫系统：1、免疫组织器官：（1）中枢：骨髓、胸腺、法氏囊（禽类）； （2）周围器官：脾脏、淋巴结、皮肤免疫系统、黏膜免疫系统。 2、免疫细胞：干细胞系、淋巴细胞系（TH、TC、TS、TDH、BC、浆细胞等）、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞等。单核细胞及巨噬细胞产生IL-l。3、免疫分子：TCR、BCR、CD、MHC、Ig、补体、细胞因子（IL-l、IL-2） 五、各免疫细胞特点：1、T细胞：是由一群细胞组成。T细胞定

28、位于淋巴结副皮质区。 可分几群，其中TH细胞是很重要的免疫细胞，CD+4可被PHA、ConA、PWM、花生凝集素刺激活化进行有丝分裂，帮助产生Ab，司管细胞免疫。TS细胞是抑制细胞，CD+8参加免疫调节。TC是细胞毒细胞。TH是成熟需要胸腺加工处理。2、B细胞：B淋巴细胞主管体液免疫细胞。表面有抗原抗体受体（SmIg）。B细胞成熟骨髓中（相当于禽类法氏囊）。 未成熟的B细胞最初可查到Ig的u链，活化B细胞可衍（yan）变成浆细胞，浆细胞能产生Ab和分泌Ab。 PWM是可以刺激B细胞有丝分裂。人类外周血中T细胞和B细胞之比为2：1。3、单核类细胞：无Ag受体，但能处理Ag，加工Ag，并向T细胞递

29、呈Ag。六、过敏反应（变态反应）：国际公认的过敏反应（变态反应）是四个型：型（速发型）、型（溶细胞型）、型（免疫复合物或血管炎型）型（迟发型）。 型（速发型）：是由IgE抗体所致，IgE与肥大细胞的IgE的Fc受体结合产生一系列变化，出现型过敏。如青霉素过敏（皮内注射过敏原），患有慢性寄生虫感染患者。IgE抗体升高显著。 型（溶细胞型）、型（免疫复合物或血管炎型）：过敏系由IgM、IgG抗体及补体等参与介导。 型（迟发型）：过敏反应是由T细胞中TDTH细胞释放淋巴因子所致。如结核菌素过敏试验（皮内注射过敏原）七、毒素变成类毒素：使毒素的毒力减弱，病理作用减弱，但免疫原性仍保留。 第五章 病毒及

30、立克次体检验第一节：病毒检验：一、病毒学总论：（一）、病毒的特点：病毒属于微生物界，其不同于其他微生物的特性如下：1、病毒一般只含有一种核酸DNA或RNA，而其它微生物，包括细菌、支原体、衣原体、立克次体，则都同时含有两种核酸。 2、病毒通过基因组复制和表达产生子代病毒的核酸和蛋白质，随后装配完整的病毒粒子。 3、病毒缺乏完整的酶系统，不具备其他生物“产能”所需的遗传信息，因此必须利用宿主细胞的酶类和产能机构，并借助宿主细胞的生物合成机构复制其核酸以及合成由其核酸编码的蛋白质，乃至直接利用细胞成分。 4、某些RNA病毒的RNA经反转录合成互补DNA（cDNA），与细胞基因组整合，并随细胞DNA

31、复制而增殖，即所谓的DNA前病毒。 5、病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动，因此对于干扰微生物的这些代谢过程而影响微生物结构和功能的抗生素，具有明显的抵抗力。 一个简单的病毒粒子，实质上只是一团遗传物质（DNA或RNA）和它外围的一层蛋白外壳。这层蛋白外壳就是衣壳， 衣壳和核酸一起总称为核衣壳。病毒不含氨基酸，这是病毒与其他微生物，包括细菌、衣原体、立克次体等又一明显区别。（二）、病毒的分类和命名：病毒的分类系统采用 目、科、亚科、属和种的等级制度。 属名应是一个以“virus”结尾的单词；亚科“virinae”； 科“viridae”；目“virales” 结尾的单词。 动物

32、病毒“种”的名称大多引用其所引起疾病的名称，后加“病毒”，兽医学上则常再加上宿主（动物的名称）种类，也有的在病名前再加最初发现该病毒的地名。毒珠名称至少应能反映该毒珠的分离地点和时间以及该毒珠的类别。根据其病毒核酸组成还可以将病毒分成DNA病毒和RNA病毒。RNA病毒可分为（1）正链RNA病毒；（2）负链RNA病毒，正链RNA病毒可以直接呈现mRNA的作用，同时又是合成互补链的模板；一般情况下，正链RNA病毒的基因组RNA具有感染性。负链RNA病毒不能直接呈现mRNA的作用，即不能直接指导合成互补链。（三）、病毒的增殖：病毒缺乏自身增殖所需的完整酶系统，增殖时必须依靠宿主细胞合成核酸和蛋白质，

33、甚至直接利用宿主细胞的某些成分，这就决定了病毒在细胞内专性寄生的特性。病毒的增殖过程大致可以分为：（1）吸附与侵入、（2）脱壳、（3）病毒成分的合成及装配、（4）释放等4个主要阶段。二、病毒学技术：（一）病毒的培养：（1）实验动物、（2）鸡胚、（3）体外培养的器官、（4）细胞，这4种都可以作为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。 1、组织培养：病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过“指示病毒”的干扰等方法加以识别。组织培养用的玻璃器皿要用（硫酸、重铬酸钾）清洗

34、。 常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助生长因子等。 常用的人工综合营养液为：MEM和RPM1640。 用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，加入碳酸氢钠溶液修正PH，根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的PH缓冲能力。能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可称之为Versen溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。动物血清中具有细胞生长所必须的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，且有很强的酸碱缓

35、冲能力。细胞培养液在细胞培养过程中可分为（1）细胞生长液（2）细胞维持液两种。细胞生长液：是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；细胞维持液：用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。细胞生长适宜的PH范围是 PH 7.27.6。细胞培养技术全过程的关键是防止污染。 2、 细胞株的保存是组织培养中一个十分重要的工作，二甲基亚砜是细胞低温保存的良好的保护剂，含10%二甲基亚砜的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞。3、 病毒学上常用的细胞类型可分为（1）原代细胞、（2）二倍体细胞、（3）传代细胞，三大类，原代细胞培养和传代细胞

36、培养的根本区别在于细胞是否能在体外无限传代。4、细胞的纯化：细胞的纯化可以用细胞克隆技术。克隆是指用无性繁殖方法产生的一组遗传上相同的细胞和生物群体的过程。（二）、病毒病的常规实验室诊断：1、病毒的分离和鉴定：（P219）病毒对细胞的感染性具有严格的选择性和特异性，因此用组织培养细胞接种病毒必须首先选择敏感细胞。（1）病毒增殖的判定：（略）（2）细胞病变（CPE）：大部分病毒在敏感细胞系均可出现CPE（细胞病变），CPE（细胞病变）可以表现为严重的细胞破坏、细胞肿大、颗粒增多、细胞融合成合胞体或无明显的细胞变化等。CPE（细胞病变）经常具有病毒“种”的特性，因此常常作为病毒坚定依据。（3）病毒

37、蚀(shi)斑技术（又称空斑）：病毒蚀(shi)斑是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的纯化或病毒悬液中感染病毒含量的测定。（用病毒蚀斑技术测定含量-病毒纯化或病毒悬液中感染的病毒）（4）病毒感染力的滴定：有两种，一种方法是用实验动物测定LD50(半数致死量)；另一种方法是在组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量。（5）病毒的保存：分离或鉴定后的病毒经过冷冻干燥后可以长期保存。2、免疫-血清学实验：免疫-血清学实验是利用抗原和抗体的特异性结合的原理进行的，主要用于两个目的： 从病料获得病毒株后，应用已知的抗病毒血清或单克隆抗体进行免疫-血清学试验，鉴定病毒的种类

38、乃至型别； 由发病动物采集血清标本，应用全病毒或特异性病毒抗原，测定发病动物体液中的特异性抗体，或进一步比较发病动物的急性发病期和恢复期血清中的抗体效价，了解病毒性抗体是否有明显的增长，从而判定病毒感染的存在。 （1）中和试验：动物在受到病毒感染后，在体内产生抗体，如果该抗体能与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染力，这种抗体就成为中和抗体。 应用已知的病毒或病毒抗原，可以测知患者体内中和抗体的存在及其效价；用已知的抗病毒血清或中和性单克隆抗体，也可以进行病毒的鉴定，因此中和试验也常用于新分离病毒株的鉴定。（2）血凝和血凝抑制试验：许多病毒能够凝集某些种类动物的红细胞，病毒凝集的红细胞种

39、类随病毒种类的不同而不同。 血凝反应可被特异性抗体所抑制，因此血凝抑制试验可以应用于： 应用于标准病毒悬液测定血清中的相应抗体；应用于特异性抗体鉴定新分离的病毒。 用枸橼酸钠配置的阿氏液具有抗红细胞凝集作用， 用于血凝和血凝抑制试验中配置红细胞悬掖。 同一患者急性发病期和恢复期双份血清（相距23周）的抗体效价增高4倍以上者，说明本次发病是由所测抗体相应病毒引起的。（3）补体结合试验：一个抗体分子与抗原结合后，可以导致数百个补体分子的激活，呈现一定程度的放大作用，所以补体结合试验是一个比较敏感的方法，一般用于人及动物血清中特异性抗体的定量检测（补体结合试验），也常用于新分离病毒的鉴定。（4）免疫

40、荧光技术：将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原-抗体反应，出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了抗原或抗体的存在。 免疫荧光技术具有抗原-抗体反应的特异性和染色技术的快速性，并可在细胞水平上进行抗原定位，故在病毒学研究和病毒病的诊断中都是一种应用很广的方法。荧光抗体染色技术包括（1）直接法、（2）间接法、（3）补体法、（4）SPA (葡萄球菌A蛋白)免疫荧光法。 （5）酶免疫技术：以酶作为标记物，通过化学方法将其与抗原或抗体共价结合，形成酶标记物，可与被检的抗原或抗体起反应，形成酶标记免疫复合物。制备酶结合物的方法很多，目前应用最广泛的有过碘酸盐法和戊二醛法。 酶免疫测定试验包括：间接法（测

41、抗体）、双抗体夹心法（测抗原）、IgM捕获ELISA（酶链免疫吸附实验）、竞争法。IgM是动物机体在受到初次抗原刺激后最早产生的一种抗体球蛋白，因此IgM捕获ELISA常应用于多种病毒病的早期诊断。抗u链抗体特异性结合IgM，可以应用于IgM捕获ELISA。IgG是主要的抗病毒抗体，在第二次抗原刺激时，由于免疫回忆，发生迅速的加强反应IgG量显著增高（分子量大）。在病毒病的诊断中，也常将这一原理用于判断病毒病的感染状况，但常常需要采集恢复期和急性期双份血清进行抗体效价的比较如IgG水平4倍或4倍以上增加具有血清学诊断意义。（6）胶体金免疫检测技术：胶体金免疫检测技术是以胶体金为载体吸附抗体和抗

42、原，完成检测特异性抗原或抗体的。胶体金免疫检测技术优于ELISA（酶链免疫吸附实验）法和免疫荧光法的最主要一点是肉眼直接判定结果。（总结：胶体金免疫检测技术就是直接用肉眼可以观察结果）。3、病毒病的分子生物学诊断：分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性，病毒病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸和蛋白质的测定。PCR（全称是聚合酶链反应），是在引物、摸板DNA和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。由于引物是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿着相反链延伸。因此，PCR（聚合酶链反应）的特异性是由人工合

43、成的一对寡核苷酸引物所决定的。PCR（聚合酶链反应）可以在数小时内对仅有的几个拷贝的基因放大数百万倍，使PCR（聚合酶链反应）扩增结果在琼脂糖凝胶电泳后形成明显可见的DNA带。溴化乙锭（EB）可以插入核酸分子之间并在紫外线下放射荧光，因此可以作为核酸分子电泳的指示剂。（核酸分子电泳的指示剂用溴化乙锭- EB）。（1）RT-PCR(聚合酶链反应)技术：由于DNA聚合酶不能以RNA为摸板合成cDNA，所以不能对RNA病毒核酸进行直接PCR（聚合酶链反应）。 首先必须提取病毒RNA。提取病毒RNA时，要注意避免RNA酶对病毒RNA的降解作用。为此，所用的试剂和用品均需要进行无Rnase处理，（Rna

44、s必须使用无热原质水制备）如加入RNA酶抑制剂或高压灭菌。加入反转录酶经过逆转录反应合成与病毒RNA互补的DNA(cDNA)，然后才能进行PCR（聚合酶链反应），这就是所谓的RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）。目前常用的逆转录酶（RT-PCR）包括MMV和AMV。RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）反应的特异性取决于模板和引物，引物序列必须是被检病毒特异的，原则上要求引物3，端碱基与模板一定要配对，对引物5，末端的碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5，末端碱基可以不与模板DNA匹配而呈游离状态，因此对引物5，末端可以进行自由修饰。PCR（聚合酶链反应）反应中，引物1又称Watson引物，是与模板正链互补的寡核苷酸链。 （2）核酸杂交检测技术：杂交的基本原理是带互补序列的单链核苷酸相遇时，会退火形成双链。“用于诊断目的”杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸，如果是阳性结果说明病毒感染的存在。在核酸分子杂交技术基础之上又发展了一系列检测DNA和RNA的技术，如Southrn blotting、Western blotting、Dit blotting和菌落杂交。 聚丙烯酰胺凝胶电泳也可简称为PAGE（PAGE聚