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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流大学本科论文模板.精品文档.哈尔滨商业大学毕业设计（论文）一株优良葡萄酒酵母菌生理生化特征的研究学 生 姓 名 张 银 指 导 教 师 梁 金 钟 专 业 生物工程 学 院 食品工程 2010年06月10日Graduation Project (Thesis)Harbin University of CommerceA fine wine physiological and biochemical characteristics of yeastStudent Zhang Yin Supervisor Liang Jinzhong Speci
2、alty Bioengineering School Food Engineering 2010-06-10毕业设计（论文）任务书姓名： 张 银学院： 食品工程班级： 06 - 2专业： 生物工程毕业设计（论文）题目：一株优良葡萄酒酵母菌生理生化特性的研究立题目的和意义：一株优良葡萄酒酵母在高品质葡萄酒的生产中起着关键性作用，掌握葡萄酒酵母的生理生化特性对葡萄酒生产指导作用的重要性不言而喻，对提高企业的效益具有重要的意义。 了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制方法。 学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。掌握鉴别、分离纯化酵母菌的实验方
3、法近几年，我国的葡萄酒产业得到了迅猛发展，2008年葡萄酒产量已达69.83万千升，工业总产值达191.68亿元。葡萄酒进口连续多年保持高速增长态势，海关统计数据表明，2008年全国瓶装进口葡萄酒总额达到2.64亿美元，比2007年新增8000万美元，增长率为43.48%。虽然我国是葡萄酒消费大国，但是我国葡萄酒产业发展仍然存在一些问题，如国产葡萄酒缺乏高端市场竞争力（高端市场长期被进口酒占领）、国产葡萄酒同质化较严重、酿酒葡萄产量和质量落后等。因此，采取一定的措施，促进我国葡萄酒产业的健康发展成为当下之急，如借鉴葡萄酒发达国家的先进管理经验，通过采取有效的质量控制措施提高国内葡萄酒的品质，根
4、据国内葡萄酒行业现状发展具有中国特色的葡萄酒文化此次实验主要利用廉价的麦芽汁作为葡萄酒酵母的营养物质，采用液态，固态等培养的方法，探讨葡萄酒酵母的最佳培养条件，生理生化特性。但是由于实验条件有限，只能采用简单的实验室药品进行试验。希望通过本试验，对提高葡萄酒酵母菌的葡萄酒的生产产量与品质与帮助，并将其应用于大规模生产中，提高工厂效益。技术要求与工作计划：1葡萄酒酵母各种培养基的配置。2葡萄酒酵母各种培养条件的控制。3葡萄酒酵母生理生化特性的测定。4. 葡萄酒酵母培养基的优化。时间安排2010-03-102010-03-20 查资料，实验方案设计2010-03-202010-05-10 葡萄酒酵
5、母生理生化试验2010-05-102010-05-25 葡萄酒酵母的扩大培养与冻干粉的制得2010-05-252010-06-05 撰写及修改毕业论文2010-06-052009-06-10 答辩准备与答辩指导教师要求：（签字） 年 月 日教研室主任意见：（签字） 年 月 日院长意见：（签字） 年 月 日毕业设计（论文）审阅评语一、指导教师评语：指导教师签字：年 月 日毕业设计（论文）审阅评语二、评阅人评语：评阅人签字：年 月 日毕业设计（论文）答辩评语及成绩三、答辩委员会评语：四、毕业设计（论文）成绩：专业答辩组负责人签字： 年 月 日五、答辩委员会主任单位： （签章） 答辩委员会主任职称：
6、 答辩委员会主任签字： 年 月 日摘 要本实验主要利用廉价的麦芽汁作为葡萄酒酵母的营养物质，采用液态，固态等培养的方法，探讨葡萄酒酵母的最佳培养条件，生理生化特性 1。得到菌体最多的最佳培养条件是：麦芽汁培养基中酵母膏为1.0%，KH2PO4为0.5% , （NH4）2SO4为0.7%, MgSO4为0.03%，PH为5.5对葡萄酒酵母的生长具有显著的影响作用，糖溶度为3%，培养温度28，接种量为10%，在180rmp的转速下培养，能最大量得到菌体。但是由于实验条件有限，只能采用简单的实验室药品进行试验。希望通过本试验，能够将结论用于实际生产中，提高葡萄酒酵母菌葡萄酒的生产产量与品质，并将其应
7、用于大规模生产中，提高工厂效益。关键词：葡萄酒酵母 生理生化特性 优化 AbstractIn this study, the main advantage of cheap malt juice as wine yeast nutrients, using liquid, solid and other training methods, the best of wine yeast culture conditions, physiological and biochemical characteristics 1. Be the most optimal cell culture cond
8、itions: malt extract medium, yeast extract 1.0%, KH2PO4 to 0.5%, (NH4) 2SO4 to 0.7%, MgSO4 was 0.03%, PH 5.5 the growth of wine yeast were significant The influence of sugar solubility of 3%, temperature 28 , 10% inoculum, incubated in 180rmp speed, can get the maximum cell number. However, due to l
9、imited experimental conditions, can only be carried out using a simple laboratory test drugs. Hope this trial can be concluded for the actual production, the increase in the production of wine yeast wine production and quality, and applied to mass production, improve plant efficiency.Key Words：wine
10、yeast, physiological and biochemical characteristics, optimizatio目 录摘 要IABSTRACTII1 绪 论51.1 葡萄酒酵母的概述51.1.1 葡萄酒酵母的来源51.1.2葡萄酒酵母的特性与应用51.2 国内、外葡萄酒酵母菌的研究现状及发展趋势71.2.1 国内葡萄酒母菌发酵生产葡萄酒的现状71.2.2 国外葡萄酒酵母菌发酵生产葡萄酒的现状71.3课题来源81.4本课题研究的目的81.5本课题研究的意义81.6本课题的研究内容82实 验 内 容92.1实验材料92.1.1菌种及主要试剂92.1.2主要实验仪器92.2实验方法
11、102.2.1葡萄酒酵母的活化102.2.1.1. 培养基的制备与菌体活化培养102.2.2 葡萄酒酵母的纯化与分离培养112.2.3葡萄酒酵母生理生化参数的测定112.2.4葡萄酒酵母培养条件的优化142.2.5麦芽汁培养基的优化173 结 果 与 讨 论183.1 葡萄酵母酵母的形态183.2 葡萄酒酵母菌生理生化特性193.2.1 葡萄酒酵母碳源的利用193.2.2葡萄酒酵母糖发酵实验结果193.2.3葡萄酒酵母对氮源的利用203.2.4 葡萄酒酵母生长曲线的测定203.3 葡萄酒酵母菌生长条件优化213.3.1 培养基pH对葡萄酒酵母生长的影响213.3.2 培养温度对葡萄酒酵母生长的
12、影响223.3.3 渗透压对葡萄酒酵母生长的影响223.3.4 溶氧量对葡萄酒酵母生长的影响233.3.5接种量对葡萄酒酵母生长的影响233.4 麦芽汁培养基的优化233.4.1 酵母膏的添加量对葡萄酒酵母生长的影响233.4.2 KH2PO4的添加量对葡萄酒酵母生长的影响243.4.3（NH4）2SO4的添加量对葡萄酒酵母生长的影响243.4.4 MgSO4的添加量对葡萄酒酵母生长的影响253.4.3 麦芽汁培养基优化的具体结果25结 论26参 考 文 献27致 谢281 绪 论1.1 葡萄酒酵母的概述1.1.1 葡萄酒酵母的来源在自然界中，天然存在一种在有氧时可进行有氧呼吸且生长旺盛，在无
13、氧时进行发酵作用且生长速度较慢的微生物。适宜pH4-5的酸性环境，生长温度一般在25-30，少数种类可耐45-47高温，耐糖，少数种类能在高浓度糖浆(如蜂蜜)中生长，耐受酒精的能力较高的微生物，此微生物是与人类生产生活息息相关常见的酵母菌2。而葡萄酒酵母是此大家族中的一个小分支，常见于成熟葡萄的表面。 UXQb = 本次试验的葡萄酒酵母菌种来源是经过诱变育种后筛选，并且在生产中经历生产条件考验的优良菌种，它对发酵设备，工艺条件等具备了很好的针对性，非常适合于工业生产4。1.1.2葡萄酒酵母的特性与应用酵母菌是单细胞真菌。菌体为卵圆形、圆形或圆柱形。无鞭毛，不运动。细胞构造具有真菌细胞的一般特征
14、，细胞壁不含纤维素，由葡聚糖、甘露聚糖等多糖为主，还含有蛋白质，脂类及几丁质等组分。酵母菌菌落圆形、大而厚，多呈乳白色，少数红色，呈油脂状或皱皮状。在液体培养基中均匀混浊，有的形成沉淀；有的浮于表面形成菌膜5。酵母菌以出芽繁殖为其特征，少数可行分裂繁殖或产生孢子。有性繁殖过程及方式与其他真菌一样十分复杂。如酿酒酵母子囊孢子萌发形成单倍体营养细胞以出芽繁殖，两个单倍体营养细胞接合形成双倍体营养细胞也以出芽繁殖，在一定条件下，双倍体营养细胞转变为子囊母细胞，然后形成子囊3。在形成子囊孢子之前有减数分裂。子囊孢子一般为1-4个。酵母菌的子囊孢子有圆形、帽形、针形、肾形等随种类而有不同6。酵母菌可以利
15、用多种糖类进行同化或发酵，一般可利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等，少数种类能利用五碳糖及淀粉。酵母菌在有氧时可进行有氧呼吸且生长旺盛，在无氧时进行发酵作用且生长速度较慢。适宜pH4-5的酸性环境，不同菌株的生长范围为pH2-8.0；生长温度大多在25-30，少数种类可耐45-47高温。一般耐糖，少数种类能在高浓度糖浆(如蜂蜜)中生长。工业用酵母菌耐受酒精的能力较高，一般发酵液中乙醇含量可达10-12%8。 UXQb = 常见的重要酵母菌各属如下9：1. 酵母菌属(Saccharomyces) 细胞圆形、椭圆形、腊肠形。发酵力强，主要产物为乙醇及CO2。主要的种有：酿酒酵母(Saccharomyes
16、cerevisiae)为酿造酒及酒精生产的主要菌种，还用于制造面包及医药工业；葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)细胞椭圆形或长形，它能将棉子糖全部发酵，还可食用及用于医药工业。2. 裂殖酵母属(Schizosaccharomyces) 细胞椭圆形、圆柱形，由营养细胞接合，形成子囊。有发酵能力，代表种为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，最早分离自非洲粟米酒，能使菊芋发酵产生酒精。3. 汉逊酵母属(Hansenula) 细胞圆形、椭圆形、腊肠形，多边芽殖，营养细胞有单倍体或二倍体，发酵或不发酵，可产生乙酸乙脂，同化硝酸盐。此菌能利用酒精为碳源在
17、饮料表面形成皮膜，为酒类酿造的有害菌。代表种为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，因能产生乙酸乙脂，有时可用于食品的增香。4. 毕赤酵母属(Pichia) 细胞形状多样，多边出芽；能形成假菌丝，常有油滴，表面光滑，发酵或不发酵，不同化硝酸盐，能利用正癸烷及十六烷，可发酵石油以生产单细胞蛋白，在酿酒业中为有害菌，代表种为粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)。5. 假丝酵母属(Candida) 细胞圆形、卵形或长形，多边芽殖，有些种有发酵能力；有些种能氧化碳氢化合物，用以生产单细胞蛋白，供食用或作饲料。少数菌能致病，代表种有：产朊假丝酵母(Candida utilis)，
18、能利用工农业废液生产单细胞蛋白；热带假丝酵母(Candida tropicalis)能利用石油生产饲料酵母。6. 球拟酵母属(Torulopsis) 细胞球形、卵形或长圆形。无假菌丝，多边芽殖，有发酵力，能将葡萄糖转化为多元醇，为生产甘油的重要菌种，利用石油生产饲料酵母，代表种为白色球拟酵母(Torulopsis candida)。 jZiW1C*a 7. 红酵母属(Rhodotorula) 细胞圆形、卵形或长形，多边芽殖，少数形成假菌丝。无发酵能力，但能同化某些糖类，有的能产生大量脂肪，对烃类有弱氧化力。常污染食品，少数为致病菌。代表种为粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。
19、葡萄酒酵母属于酵母菌属中的酿酒酵母，这是发酵工业上最常用的菌种之一按细胞长与宽的比例可将其分为三组。葡萄酒酵母细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发达也不典型。主要用于果酒，啤酒，蒸馏酒和酵母的生产。1.2 国内、外葡萄酒酵母菌的研究现状及发展趋势1.2.1 国内葡萄酒母菌发酵生产葡萄酒的现状近几年，我国的葡萄酒产业得到了迅猛发展，2008年葡萄酒产量已达69.83万千升，工业总产值达191.68亿元。葡萄酒进口连续多年保持高速增长态势，海关统计数据表明，2008年全国瓶装进口葡萄酒总额达到2.64亿美元，比2007年新增8000万美元，增
20、长率为43.48%。虽然我国是葡萄酒消费大国，但是我国葡萄酒产业发展仍然存在一些问题，如国产葡萄酒缺乏高端市场竞争力（高端市场长期被进口酒占领）、国产葡萄酒同质化较严重、酿酒葡萄产量和质量落后等。通过引进消化国外先进酿酒工艺， 合资建设葡萄酒厂，产业结构的调整，葡萄品种与国际接轨等，全面提高我国葡萄酒的酿制水平，众多葡萄酒企业已采用了具有国际先进水平的气囊压榨、浸提、低温旋转发酵、人工酵母、急速冷冻、全自动葡萄酒灌装生产线等生产技术及装备。现阶段我国葡萄酒企业的酿酒工艺、技术水平与世界同步，从原辅材料、工艺技术到生产设备，达到国际先进水平。随着人们生活水平的提高、葡萄酒文化的深入传播和葡萄酒消
21、费市场的积极培育， 产品高端化成为葡萄酒行业的重要趋势，酒庄酒、冰酒、年份酒、分级酒、树龄酒、产地酒、品种酒等概念化的高端酒在市场上占据的份额越来越重要，直接拉升了吨酒均价。2006 年吨酒均价已经达到2.6 万元，较2004 年上涨幅度超过40 %，目前这一趋势仍在延续11。1.2.2 国外葡萄酒酵母菌发酵生产葡萄酒的现状近几年，世界葡萄酒年产量、葡萄种植面积、人均葡萄酒年消费量呈连续下滑趋势， 而全球性的金融危机更加剧了这一趋势。2008 年全球葡萄酒年产量2765 万t、葡萄种植面积780 万km2。世界上三大葡萄酒生产国为意大利（496.8 万t）、法国（436.5 万t）、西班牙，这
22、3 个国家葡萄酒产量占全球总产量的50 %。2008 年，全球葡萄酒年销售量2430 万t，年销售总产值达1 千亿美元，人均葡萄酒消费量为4.5 L，较1990年下降1 L，达到近年来的最低点。人均葡萄酒消费量下降的主要原因是由于作为葡萄酒主要消费市场的欧盟国家生活方式的改变，尤其是法国、意大利，这些国家均有着以葡萄酒佐餐的传统。随着欧洲人生活节奏加快，软饮料、果汁、瓶装水逐渐在某些场合取代了葡萄酒的重要位置，尤其是年轻消费者已不再青睐葡萄酒17。1980 年，法国和意大利人的葡萄酒消费量占到全球消费总量的45 %，但2008 年降至24 %。欧盟人均消费量从1995 年的30 L降至2008
23、 年的28 L。美国是世界增长最快的葡萄酒消费国之一，2008 年其人均葡萄酒消费量为9 L。法国、意大利分别为51 L 和44 L，梵蒂冈是全球人均葡萄酒消费量最高的国家，为62 L11。1.3课题来源梁教授工厂委托项目。1.4本课题研究的目的此次实验主要利用廉价的麦芽汁作为葡萄酒酵母的营养物质，采用液态，固态等培养的方法，探讨葡萄酒酵母的最佳培养条件，生理生化特性。但是由于实验条件有限，只能采用简单的实验室药品进行试验。希望通过本试验，能够提高葡萄酒酵母菌葡萄酒的生产产量与品质，并将其应用于大规模生产中，提高工厂效益。 了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。 学习和掌握麦芽汁
24、培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。掌握鉴别、分离纯化酵母菌的实验方法1.5本课题研究的意义一株优良葡萄酒酵母在高品质葡萄酒的生产中起着关键性作用，掌握在发酵生产中起关键性作用的葡萄酒酵母的生理生化的重要性，对生产的指导作用的重要性不言而喻，掌握了优良葡萄酒的生理生化特性，对葡萄酒的发酵生产工艺进行优化，对提高企业的效益具有重要的意义。1.6本课题的研究内容本课题以葡萄酒酵母为研究中心,检测其生理生化特性 ,探讨其最佳培养，发酵条件，获得最佳菌种的条件,优化麦芽汁培养基，然后利用以优化的麦芽汁培养基，在葡萄酒酵母菌最优的生长条件下进行液体培养，获得菌体细胞，然
25、后在真空冷冻干燥器中冷冻干燥，获得酵母菌冻干粉。2实 验 内 容2.1实验材料2.1.1菌种及主要试剂2.1.1.1菌种优良葡萄酒酵母菌（指导老师给），进过诱变筛选，生产考验的菌种。2.1.1.2主要试剂表 2-1 主 要 试 剂试验材料规格产地葡萄糖生化试剂天津市化学试剂一厂麦芽糖生化试剂中国科学院上海生物化学研究所蛋白胨生化试剂天津化学试剂批发厂磷酸二氢钾分析纯天津市天大化工实验厂磷酸氢二钾分析纯天津市天大化工实验厂硫酸镁分析纯天津市天大化工实验厂氯化钠分析纯天津市天大化工实验厂盐酸分析纯天津四通化工厂丙酮分析纯天津四通化工厂硫酸钾分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心氯化钾分析纯天津市科密欧
26、化学试剂开发中心七水硫酸镁分析纯北京化工厂硫酸亚铁分析纯天津市赢达稀贵化学试剂厂硫酸铵分析纯天津市基准化学试剂有限公司2.1.2主要实验仪器表 2-2 实 验 仪 器实验设备与仪器型号产地离心机LG10-2.4A北京京力离心机有限公司电子天平MD200-3型上海天平仪器厂糖度计RHB-32ATC泰斯特仪器有限公司低温冷冻离心机Sigma 216K德国 SIGMA电热恒温培养箱DHG-9053A南京电器三厂立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KB上海申安医疗器械厂血球计数板XB-K-25玉环县求精医用仪器厂制造显微镜Motic-BA 210麦克奥迪实业集团有限公司（福建）2.2实验方法通过前人的实验
27、，可以简单的确定葡萄酒酵母菌生理生化实验方向，确定环境对其影响的实验方案与培养葡萄酒酵母的实验条件。葡萄酒酵母生理生化研究的主要内容有：糖发酵实验、碳源同化实验、氮源同化实验等。葡萄酒酵母生长的主要影响因素有：培养基PH、渗透压、温度、接种量及溶氧量等 10。除此之外，我对葡萄酒酵母的进行了优化，微生物的生长过程是微生物有效利用环境中的营养物质通过自身的生长代谢活动来获取菌体的过程，生长水平不仅取决于生产菌种自身的性能，更取决于生长环境，使菌种的生长能力充分表达出来。对于特定的微生物而言，就要研究其对环境条件，如培养基、培养温度、pH以及氧的等需求，菌种处于产物合成的最佳环境中，菌的代谢向需要
28、的方向进行，达到最佳的生长水平。我们在葡萄酒酵母培养条件优化过程中，对葡萄酒酵母的培养基的pH、培养温度等影响因素进行了初步研究 15。2.2.1葡萄酒酵母的活化2.2.1.1. 培养基的制备与菌体活化培养葡萄酒酵母活化培养基制备： 新鲜葡萄汁 100mL ，蔗糖 1.5% ，琼脂 2%。将培养基分装于干净的三角瓶内，在121 、0.1MPa 灭菌15 min后，在无菌操作台上凉至50左右，然后倒入平板中，待平板凝固后用接种环划线接种，接种后放置在28的恒温培养箱中，培养4872 h，长出均落后放置于冰箱中备用5。2.2.2 葡萄酒酵母的纯化与分离培养葡萄酒酵母的纯化与分离培养基还是用上述活化
29、培养基。葡萄酒酵母的分离纯化还是用平板划线分离法。用接种环蘸取少许已活化的菌种，然后在琼脂平板面上分区进行划线，划线接种的平板经过培养后会得到呈分散状态的单菌落。具体操作方法：接种环灭菌从琼脂平板（A）中粘去取菌种划线分离（B）在适宜的条件下培养52.2.3葡萄酒酵母生理生化参数的测定2.2.3.1葡萄酒酵母菌糖发酵试验(1)实验原理酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。因此，这是鉴别酵母菌种类的一项重要依据。酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫变黄）或溴麝香草酚蓝（pH7.6-6.0由蓝变黄）指标剂颜色的改变来
30、确定。产气可由发酵管气泡的产生予以证实。(2)糖发酵基础液:1.6%溴甲酚紫，葡萄糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖，葡萄酒酵母斜面菌种。(3)糖发酵培养基：蛋白胨 1 g,Nacl 0.5 g ，葡萄糖（或其他种类的糖）1 g ，蒸馏水100 mL， 112灭菌30min(4)实验内容：a、糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的1%加入糖，分装于杜氏发酵管中（培养液的高度约为4-5厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约0.42.02.5厘米）一支。每种糖设三个重复管，121高压灭菌15分钟。b、将啤酒酵母分别接入上述各发酵管中，置30下培养48-72小时，另以不接种者作对照。c、如产酸则培养液pH值下降而
31、变黄色；如产气，则必先产酸，并在杜氏小管顶端出现气泡。d、结果记录。以“ 酸”表示产酸，“0”表示产气，“”表示产酸产气，“”表示无变化，“碱”表示产碱7。2.2.3.2葡萄酒酵母菌碳源同化试验(1)实验原理：碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的50%，为酵母菌生命活动提供所需的能量和组成其结构的物质。酵母菌对各种碳源的利用，因种类不同而异。这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。 (2)无碳基础培养基，葡萄酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糖溶液。(3)实验内容a、液体试管法每管加无碳基础培养基5毫升，加被测试的某种碳源，并以葡萄糖作为对照。接入葡萄酒酒酵母，2
32、8下培养1-2周，观察结果。b、生长图谱法无碳培养基内加入2%的水洗琼脂，融化后冷却至45-50，到至平板。接种新鲜培养的啤酒酵母于1毫升无菌生理盐水内，搅匀后倒入上述未凝平板内，摇匀待凝。皿底用特种蜡笔写上被测试各种碳源的标记。用不锈钢匙，按标记加入相应的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作对照。28下培养24-48小时后观察结果。c、结果观察液体试管中是否形成醭，环岛等。生长图谱中测量菌落大小，说明对碳源的利用情况7。2.2.3.3葡萄酒酵母菌氮源同化试验(1)实验原理：酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外，故酵母菌对复杂的蛋白质不能利用，酵母菌对一些较简单的含氮化合物的利用程度也不一致。 (2)无氮基础培
33、养基，葡萄酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和尿素溶液。(3)实验内容：a、液体试管法方法同上，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白对照。b、生长图谱法方法同上，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白对照。c、结果观察液体试管中溶液pH值的变化。生长图谱中测量形成菌落的大小，说明对各种氮源的利用情况。2.2.3.4葡萄酒酵母菌生长曲线测定(1)实验原理：葡萄酒酵母菌属于单细胞真核型微生物，把一定数量的酵母菌接种于的液体培养基中，在适宜的温度下培养时，它的生长过程具有一定的规律性。在其生长过程中，定时取样测定酵母菌细胞数量，然后以酵母菌细胞数的对数作纵坐标，生长时间作横坐
34、标，绘制所得的曲线叫生长曲线。此生长曲线大致可划分为四个阶段：调整期、对数生长期、稳定期和衰退期6。(2)酵母菌增殖培养基（YEPD培养基）葡萄糖 2g，胰蛋白胨 2g，酵母提取物 1g，蒸馏水 100 ml PH 5.05.5 ，121灭菌20min。 (3)实验内容：a、将培养24小时左右的葡萄酒酵母斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，以3000转/分的速率离心，得菌体。将酵母菌体沉淀物再用无菌水洗2-3次后，制备葡萄酒酵母菌悬液（细胞数量约106左右/毫升），测数备用。b、取上述菌悬液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培养液的试管中，25下培养，以此为起始时间，记录起始溶液的细胞数。并在培养1，2，4，
35、6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小时时分别取样检测酵母菌细胞数量。c、酵母菌细胞数量的检测方法：血球计数板计数法。此法是先将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，使菌落数约为105-106个/毫升，取一滴稀释液滴于血球计数板内，在显微镜下直接计算细胞总数5。d、绘制生长曲线以酵母菌细胞数的对数作为纵坐标，以培养时间作为横坐标，画出酵母菌的生长曲线。并分析酵母菌群体的生长规律。计数所用的血球板的规格为25*16酵母细胞数（1ml培养液）=80小格内酵母细胞数/80*400*10000*菌液稀释倍数2.2.4葡萄酒酵母培养条件的优化2.2.4.1培养基pH对葡萄酒酵母的影
36、响实验(1)实验原理：微生物作为一个群体，其生长的pH范围很广泛，但绝大多的数种类都生长在pH 59之间，而每种微生物都有其生长的最高、最低和最适pH。现以培养基的pH为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适pH。(2)豆芽汁葡萄糖液体培养基，葡萄酒酵母斜面菌，恒温培养箱，移液管，培养皿等。(3)实验内容：a、配置豆芽汁葡萄糖液体培养基，分别调至pH 3、5、7、9和11，每管pH分装3管，每管盛培养液5ml，灭菌备用。将葡萄酒酵母制成酵母菌悬液，每管接种一滴（或0.1ml），摇匀，置28恒温箱中培养。b、结果观察：培养24h后观察结果。根据培养液的浑浊度判定微生物在不同PH的生长情况：以“”表示不生长
37、，“+”表示生长，并以“+”、“+”、“+”表示不同的生长量，记录实验结果。2.2.4.2培养温度对葡萄酒酵母的影响实验(1)实验原理：不同微生物生长繁殖所要求的最适温度不同。根据微生物生长的最适温度范围，可分为高温菌、中温菌和低温菌。自然界中绝大多数微生物属中温菌，葡萄酒酵母菌也属中温菌。现以培养温度为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适生长温度。(2)豆芽汁葡萄糖培养基，葡萄酒酵母斜面菌，恒温培养箱，移液管，培养皿等。(3)实验内容：a、配置豆芽汁葡萄糖培养基，分别取8支试管，每管装5ml豆芽汁葡萄糖培养液，灭菌后分别标明20、28、37和45四种温度，每种温度两管。向每管接入培养1820h的葡萄
38、酒酵母菌液0.1mL，混合均匀。b、结果观察：将上述各管分别置于不同温度下，进行振荡培养24h，观察结果。根据菌液的浑浊度，以“”表示不生长，“+”表示生长，并以“+”、“+”、“+”表示不同的生长量，记录实验结果。2.2.4.3渗透压对葡萄酒酵母的影响实验(1)实验原理：渗透压对微生物的生长有重大的影响。等渗溶液适合微生物的生长；高渗溶液可使微生物细胞脱水发生质壁分离；而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，甚至使细胞破裂，现以培养基的渗透压为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适生长渗透压。 (2)豆芽汁葡萄糖培养基，葡萄酒酵母斜面菌，恒温培养箱，移液管，培养皿等。(3)实验内容：a、以察氏培养基为基础，把其
39、含糖量分别为3%、10%、20%、40%配置培养液，每种含糖量两管，每管装5ml。灭菌后，各管分别接入葡萄酒酵母0.1ml。以肉膏蛋白胨培养基为基础，把其NaCl含量分别为0.5%、2.5%、5%、10%配置培养基，每种NaCl量2管，每管装5ml。灭菌后，各管分别接入葡萄酒酵母0.1ml。b、结果观察：将接种酿酒酵母的各管置于28恒温培养箱中培养，24h后观察结果。根据菌液的混浊度，以“”表示不生长，“+”表示生长，并以“+”、“+”、“+”表示不同的生长量，记录实验结果。2.2.4.4溶氧量对葡萄酒酵母的影响实验(1)实验原理：不同微生物生长繁殖所要求的溶氧不同。根据微生物对氧的需求，可把
40、微生物分为需氧菌和厌氧菌两大类，又可分为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌、耐氧菌和厌氧菌。葡萄酒酵母菌属于兼性厌氧菌。现以培养温度为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适生长温度。(2)豆芽汁葡萄糖培养基，葡萄酒酵母斜面菌，摇床培养器，移液管，培养皿等。(3)实验内容：a、配置豆芽汁葡萄糖培养基，分别取5支250ml的三角瓶，每管装50ml豆芽汁葡萄糖培养液，灭菌后分别标明0 rpm/min、50 rpm/min、100 rpm/min、150 rpm/min和180 rpm/min五种转速。向每支三角瓶中接入培养1820h的葡萄酒酵母菌液1mL，混合均匀。b、结果观察：将接种酿酒酵母的各个三角瓶分别放置于
41、不同转速的摇床中培养，24h后观察结果。根据菌液的浑浊度，以分度光度计测各个试管中菌液的OD值，记录实验结果。2.2.4.5接种量对葡萄酒酵母的影响实验(1)实验原理：不同的接种量对葡萄酒酵母生长速度有重要影响。现以接种量为单因数，探讨葡萄酒酵母的最适的接种量。(2)YEPD培养基，葡萄酒酵母斜面菌，摇床培养器，移液管，培养皿等。(3)实验内容：a、配置YEPD培养基，分别取9支250ml的三角瓶，每管装50mlYEPD培养液，灭菌后分别标明0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%和30%九种接种量。向每支三角瓶中接入培养10h的不同量的葡萄酒酵母菌液，混合均匀，自然pH
42、， 28，180rpm，培养24h。b、结果观察：将接种酿酒酵母的各个三角瓶放置180rpm转速的摇床中培养，24h后观察结果。根据菌液的浑浊度，以分度光度计测各个试管中菌液的OD值，记录实验结果。2.2.5麦芽汁培养基需要优化的麦芽汁培养基：麦芽汁 1015 Br 酵母膏 1.5% KH2PO4 0.5% （NH4）2SO4 0.5% MgSO4 0.05% PH 6.06.5在115灭菌15min 53 结 果 与 讨 论3.1 葡萄酵母酵母的形态葡萄酒酵母（Rhodotorula sp.）细胞形状多为卵形和长卵形为主（如图3-1所示），也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为29。常形成
43、假丝，但不发达，也不典型，其形成的菌落与细菌相似，但较之大而厚，菌落表面湿润、粘稠，易被挑起，菌落呈乳白色4。图3-1 显微镜下所观察到的葡萄酒酵母菌与菌落形态3.2 葡萄酒酵母菌生理生化特性3.2.1 葡萄酒酵母碳源的利用通过对葡萄酒酵母的碳源同化实验，可得到以下结果：表3-1葡萄酒酵母的碳源同化实验实验碳源葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖OD值 0.4120.3920.3850.256从表3-1中可以看出葡萄酒酵母对葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的利用率分大小别为：葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖。在液体培养5天后，在试管中出现菌膜，环岛；葡萄酒酵母在液体培养集中均匀生长，发生混浊，产生沉淀。3.2.2葡萄酒酵母糖发酵实验结果 通过对葡萄酒酵母的糖发酵试验，可得到以下结果：表3-2葡萄酒酵母的糖发酵试验葡萄糖0酸+乳糖碱无明显变化蔗糖酸无明显变化麦芽糖酸无明显变化注：“ 酸”表示产酸，“0”表示产气，“”表示产酸产气，“”表示无变化，“碱”表示产碱。从表31中可以看出葡萄酒酵母发酵葡萄糖产气，产酸，培养液显酸性；发酵乳糖培养液显碱性；发酵蔗糖、麦芽糖，培养液现酸性，其