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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流基因工程课程论文.精品文档.青岛农业大学动物基因工程课程论文题 目： 转基因技术在动物繁育上的研究 姓 名： 丁肖 学 院： 动物科技学院 专 业： 动物医学专业 班 级： 2011-04 学 号： 20110584 任课教师： 闵令江 二一三年四月十日转基因技术在动物繁育上的研究动物医学专业 丁肖任课教师：闵令江 指导教师：闵令江摘要：转基因动物是现代生物技术中一个极其重要的研究领域，目前已经有转基因小鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、鸡和鱼等多种转基因动物问世。本文综述了转基因动物的制作方法、转基因动物的应用研究以及所取得的重要成就，转基因技术
2、的研究展望。 以猪为例：猪既是重要的经济动物,又是常用的实验动物。从其自然特性来看,猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类最接近。因此,猪成了转基因动物的热点。研究初期,人们主要致力于培育出生长速度快的猪群,目前,人们主要尝试用转基因猪生产不易获得或用重组菌发酵无天然功能蛋白和用于异种器官移植的器官。转基因猪的研究与培育,不仅可以促进其自身基因表达和调控的研究,而且能为大家畜的转基因研究提供重要的技术依据。1猪的转基因技术从1985年Hammer等1 得到第1批转基因猪到现在,有关转基因猪的研究已有10几年的历史,转基因方法主要有以下6种,但比较成熟和公认的方法仍然是受精卵原核的显微注射法
3、。 我们希望通过转基因技术的应用使得动物在遗传育种上能够有很大的进步。关键词：转基因技术；显微注射；基因打靶；乳腺生物发生器Abstract: Mastitis is a disease of the mammary gland caused by pathogens that find their way into the lumen of the gland through the teat canal. Mammary gland infections cost the US dairy industry approximately $2 billion dollars annually
4、 and have a similar impact in Europe. In the absence of effective treatments or breeding strategies to enhance mastitis resistance, we have created transgenic dairy cows that express lysostaphin in their mammary epithelium and secrete the antimicrobial peptide into milk. Staphylococcus aureus, a maj
5、or mastitis pathogen, is exquisitely sensitive to lysostaphin. The transgenic cattle resist S. aureus mammary gland challenges, and their milk kills the bacteria, in a dose dependent manner. This first step in protecting cattle against mastitis will be followed by introduction of other genes to deal
6、 with potential resistance issues and other mastitis causing organisms. Care will be taken to avoid altering milks nutritional and manufacturing properties. Multi-cistronic constructs may be required to achieve our goals as will other strategies possibly involving RNAi and gene targeting technology.
7、 This work demonstrates the possibility of using transgenic technology to address disease problems in agriculturally important species. Keywords: transgenic technology; microinjection; gene targeting; mammary bioreactor在动物遗传育种中，传统的动物品种改良方法是通过纯系繁育和配套杂交，该方法带来了明显的经济效益，有力地促进了动物产业的发展，提高了人们的生活水平。但品种改良周期比较
8、长，也会产生负面的影响。转基因技术是在上世纪80年代初发展起来的一项生物技术。如今，转基因技术正在对动物育种产生一场新的革命。转基因技术是将外源基因通过载体导入受体生物体内，让其获得新特性的一门复杂技术。由于这一技术能够实现基因的种间转移，用于动物育种将大大提高育种的目的性，加快育种进程。自Palmiter等1982年将大白鼠生长激素基因显微注射到小白鼠受精卵，获得比正常小鼠大一倍的“超级巨鼠”以来，世界各国科学家竞相开展转基因技术研究，并通过多种转基因方法在猪、牛、鸡、兔、羊等动物上获得成功。转基因技术在定向改造生物体中有着无法可比的优越性。 转基因技术在动物品种改良的过程中，有着确定的目标
9、、周密的设计、精确的操作，是目前最先进的技术。1 动物转基因技术所谓转基因就是将目的基因导入到受体细胞的过程。1997年，克隆羊Dolly的诞生，开创了哺乳动物体细胞核移植技术的先河，随后，乳腺中表达人凝血因子IX的转基因克隆羊Polly培育成功。2005年，抗乳房炎转基因牛的诞生，2006年，多不饱和脂肪酸转基因克隆猪的培育成功，标志着转基因动物育种进入了新的发展历程。随着基因工程技术的不断发展，转基因动物技术将会不断得到改善，从而在未来的动物育种中发挥巨大的作用。目前转基因动物育种技术主要有一下几种方法。1.1 逆转录病毒载体导入法逆转录病毒法是最早用于生产转基因动物的方法，由于转染过程中
10、不能准确控制整合时间，得到的转基因动物大都是嵌合体，所以没有得到更深入的发展。1974年，Jaenisch和Mintz将SV40 DNA注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠肝、肾组织中有SV40 DNA整合。此后，Jaenisch等成功地用逆转录病毒法获得了转基因小鼠。随后，转基因鸡和牛也相继产生。1.2 显微注射法显微注射法 (Microinjection) 是指通过显微操作仪把外源基因注入受体动物的受精卵，外源基因整合到受体细胞染色体组上，发育成转基因动物的技术。这是发展最早、目前使用最为广泛，也是最有效的方法，已经生产出了转基因小鼠及兔、绵羊、猪、牛、鱼和鸡等各种转基因动物。显微注射法的优点
11、是外源基因的转移率和整合效率都较高，小鼠为6%40%，猪和羊分别为0.98%和0.1%，鱼类可达10%75%，外源基因的长度不受限制，可向动物原核胚导入250kb左右的DNA片断。但该方法操作技术复杂，设备昂贵，导入外源基因的拷贝数无法控制，外源基因随机整合到基因组内，常导致宿主DNA染色体序列丢失或重排，造成严重的生理缺陷。1.3 精子载体法精子载体法是用精子作为基因转移的载体 (Vector) 生产转基因动物。大多数物种的精子都有一定的摄取外源DNA的能力，可以通过受精过程把外源基因导入到受精卵中。精子介导载体法获得转基因动物的效率能达到30%左右。1989年，意大利的Lavitrano等
12、通过精子介导成功获得转氯霉素乙酰转移酶基因 (CAT)的转基因小鼠。1.4 转基因克隆技术体细胞克隆是将分化的体细胞核导入去核的卵母细胞中，并重新发育成个体的过程。体细胞核移植技术的建立，宣告了动物分化的体细胞可以被逆转为全能型的胚胎，并发育成完整的动物个体。转基因克隆技术是以体细胞核移植技术及细胞转染技术为基础，将外源基因导入到体细胞核内，再以此转基因细胞为核供体进行动物克隆的方法。体细胞核移植技术使得大批量的生产相同遗传背景的动物成为可能，在很大程度上提高了转基因动物生产的效率和稳定性，为培育大规模的有育种价值的群体提供了技术条件。1.5 基因打靶技术基因打靶技术包括去除致病或不利基因座位
13、的基因敲除技术，以及将目的基因定点整合到基因组特定位点的基因敲入技术。2000年，Mcgreath等首次应用基因打靶技术，用人的基因替换了羊的基因，生产了转基因克隆羊，证实了基因打靶技术可用于生产转基因家畜。2002年及2003年，Lai等和Sendai等利用基因敲除的方法分别获得了-1，3-半乳糖苷转移酶基因灭活的转基因猪和转基因牛。1.6 慢病毒载体法慢病毒载体技术是一种高效的转基因动物制备技术，其转染效率可达60%以上。2003年，Clark等利用慢病毒载体制备转基因动物的效率可达80%100%，生产1只转基因绵羊只需5只受体母羊，而传统的纤维注射法则需70只受体母羊。目前的转基因鸡生产
14、也主要采用慢病毒载体技术。1.7 胚胎干细胞法胚胎干细胞（ES cell）是高度未分化的全能干细胞，通过人工培养和定向诱导，可分化为多种组织细胞。将外源基因导入ES细胞后进行必要的筛选，筛选出的细胞转移到原肠时期的胚胎中便会得到带有目的基因的嵌合体动物，再通过杂交的方法得到一个品系。目前这种方法仅用于转基因小鼠的基础研究。2 转基因技术在动物育种上的研究自Palmiter等1982年将大白鼠生长激素基因显微注射到小白鼠受精卵，获得比正常小鼠大一倍的“超级巨鼠”以来。这一实验的成功揭开了转基因动物研究的序幕，此后转基因动物研究发展迅速，短短二十几年间，人们相继获得了转基因兔、猪、羊、牛、鱼和鸡，
15、并成功培育出了一些肉质优良、快速生长、具有抗病性以及生产生物材料的转基因家畜。转基因育种，即通过转基因技术将外源基因导入动物受精卵内组成一个新的融合基因，使其在动物体内整合与表达，产生具有新遗传特性的动物。转基因技术育种可以避开物种间杂交不育的生殖隔离，在较短时期内培育出常规方法不能育成或难以育成的动物品种，从而加快动物改良进程，使选择效率提高，改良机会增多，因而极具研究价值。2.1 转基因技术在猪遗传育种上的研究与应用1985年，Hammer R. E.等人首次利用显微注射法得到了1头转基因猪。与同窝非转基因猪相比，生长速度、饲料利用率均有提高，胴体脂肪率降低。1989年，Pursel等，把
16、牛的生长激素基因转入猪体内，获得2个猪的家系，其生长速度提高1114，饲料转化率提高1618；使用类胰岛素生长因子-I (IGF-1) 构建转基因猪也可以加快猪的生长速度，Pursel等又把IGF-I基因转入猪中，首次获得表达IGF-I的转基因猪。当年，我国研究人员将猪GH基因转入湖北白猪受精卵中获得首批转基因猪。经过几个世代的观察，其生长速度与饲料利用率分别比同窝提高13%和10。1990年，中国农业大学培育的转基因猪，生长速度显著提高，超过对照组40。1991年，Wall等将小鼠编码乳清酸蛋白 (WAP) 的基因转移给猪，获得了3头转基因猪，对这3头转基因猪的整个泌乳期的乳汁进行检测，发现
17、小鼠的WAP在奶中的浓度为l g/l。相应的mRNA只存在于乳腺中在转基因猪的乳中。WAP占总乳量的3%。1993年，Suetlali等将含有编码小鼠粘病毒抗性蛋白 (Mxl蛋白) 的cDNA的3种基因构件分别整合到猪染色体中，获得抗流感病毒的转基因猪，但基因转移效率很低。1995年，湖北农业科学院与中国农业科学院兰州兽医研究所合作，得到了抗猪瘟病毒的转基因猪。1998年，Vin将猪生长激素因子与MT启动子融合基因注入猪受精卵内，获得1头可表达猪生长激素的转基因猪。1998年，中国农业大学培育的转基因群脂肪减少10，瘦肉率增加68。2004年，日本科学家Saeki将菠菜-12去饱和酶 (fad
18、-2) 基因转入猪体内并在脂肪组织特异表达，培育出6头转基因猪，猪体内-6型不饱和脂肪酸的含量明显提高，且不饱和脂肪酸含量高于普通猪20。2006年4月，美国密苏里-哥伦比亚大学的Lai等获得了l0头转有线虫的fat-1基因 (-3去饱和酶基因) 的体细胞克隆猪，FAT-1蛋白可将猪体内的-6型多不饱和脂肪酸转化为-3型，转基因克隆猪体内-6/-3的比值达到12，远远低于正常猪的8左右，大大提高了猪肉的营养价值。多不饱和脂肪酸转基因克隆猪的培育成功，标志着转基因动物育种进入了新的发展历程。2006年4月，韩国ParkJK等通过精子微注射猪受精卵获得了整合人重组促红细胞生成素的转基因猪，对Fl代
19、以及F2代泌乳母猪的乳样分析表明，其氨基酸组成与商业化的重组hEPO完全相同。2006年12月22日，我国首例成体体细胞“克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国、日本之后第四例绿色荧光蛋白转基因猪。绿色荧光蛋白转基因猪的出生，标志着我国在转基因克隆猪技术研究领域步入世界先进水平行列。这项技术为家猪的目标育种、人类疾病医疗模型猪的建立以及生产为人类器官移植提供器官的特殊家猪提供了可靠技术平台，从而为畜牧业发展和医学研究开辟了新的天地。2008年8月，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和军事医学科学院生物工程研究所
20、合作同样获得了转有-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因克隆猪。2008年9月，吉林大学农学部畜牧兽医学院和军事医学科学院第十一所合作，得到了带有抗猪瘟病毒转基因猪的克隆后代，经检测3只克隆猪均带有抗猪瘟病毒基因。2009年，生产高比例的抗原特异性人源抗体的转染色体牛的出生，是转基因动物生产药用蛋白的又一个里程碑。2.2 转基因技术在牛遗传育种上的研究与应用美国Genzyme Transgene公司用酪蛋白启动子与人乳铁蛋白 (hLF) 的cDNA构建了转基因载体，通过显微注射法获得世界上第1头名为“Herman”的转基因公牛，该公牛与非转基因母牛生产转基因后代，1/4后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白
21、(McEcog等，1990)。Krimpenfort等 (2001) 利用显微注射技术向牛体外受精早期胚胎注射外源基因，通过非外科手术法进行胚胎移植，在所生的19头牛中，经Southern-blot检测有2头为转基因牛。荷兰的GenPharm公司用相同的方法也培育出含人乳铁蛋白的转基因牛，牛奶中人乳铁蛋白含量为1000g/ml (Valander等，1992)。Berkel等 (2002) 利用牛的-s1-酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组的6.2 kb片段构建转基因载体，通过显微注射获得转基因牛，ELISA结果分析表明，转基因牛奶中人乳铁蛋白的含量为3002800g/ml。在国内，上海医学遗传研
22、究所黄淑帧等 (2000) 利用向体外受精的早期胚胎中注射外源基因的方法成功培育出了我国第1头转有人血清白蛋白 (hALB) 基因的转基因牛，该成果被评为1999年中国十大科技进展。2.3转基因技术在羊遗传育种上的研究与应用Nancarrow 等 (1991) 把来自于优质羊毛的一种A2蛋白的主要成分 (半胱氨酸) 基因导入绵羊原核期胚胎，获得的转基因羊的产毛率明显提高。Powell 等 (1994) 将毛角蛋白型中间细丝基因导入绵羊基因组，获得的转基因羊毛光泽亮丽，羊毛中羊毛脂的含量得到明显提高。Damak等 (1996) 将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF-I cDNA融合基因显微注入
23、绵羊原核期胚胎，得到转基因羊净毛平均产量比非转基因羊提高了6.2%。Bawden 等 (1998) 将毛角蛋白型中间细丝基因导入绵羊基因组并使其在皮质中特异表达，结果转基因羊毛光泽亮丽，羊毛中羊毛脂的含量得到明显的提高。Adams 等 (2005) 通过对成年的转绵羊生长激素基因的转基因绵羊性能进行测定，发现生长速度和羊毛产量都比对照组显著提高。目前，新西兰、澳大利亚、英国等主要产羊毛国家正致力于开发一种可以生产彩色羊毛的高产转基因羊。Clement 等 (1994) 将Visna病毒的衣壳蛋白基因转入绵羊，获得了抗病能力明显提高的转基因羊。朊病毒 (PrP) 是一种对羊极为致命的病毒粒子，能
24、引起羊的搔痒症 (scrapie) 等致命性中枢神经系统机能退化症 (Hill 等，1997)。这些疾病已使众多欧洲国家遭受了严重的经济损失。PrP为单拷贝基因，从人们从对PrP敲除小鼠的实验来看，它们都不受朊病毒疾病的感染，且没有发现其它副作用(Bueler 等，1992)。因此如果将羊的PrP基因敲除掉，产生抗PrP种群，这对畜牧业生产和人类健康都有着积极的作用。Denning 等 (2001) 从绵羊体细胞剔除PrP基因后，经核移植生产出4只敲除掉PrP基因的羊羔，其中一只存活了12 d。Yu等 (2006) 报道利用基因打靶技术获得敲除了一个PrP基因位点的体细胞克隆山羊，经过3个月观
25、察这些基因敲除羊没有异常表现，该中心正在进行PrP基因位点双敲除研究。3 转基因技术在动物育种中的应用3.1 促进动物生产，改善畜产品质量常规育种改良畜禽品种进展较慢，而且有些种畜的生产性能已达到相当高的水平，很难获得较大的进展，利用转基因技术，将所需的优良基因直接转入待改良群体中，从而培育出具有优良品质的转基因品系。生长激素（GH）基因是转基因研究中运用最早的基因， Hammer于1985年， Rexroad于1989年及Pursel于1993年分别获得转人的生长激素释放因子 (hGRF) 的转基因小鼠、转基因母猪和转基因绵羊。提高了猪的生长速度和饲料利用效率，胴体脂肪率也明显下降。1994
26、年，德国成功培育出转入生长素的转基因猪，使世界上出现了壮如小牛的“超级猪”。3.2 提高抗病能力和适应性畜禽传染病一直是严重威胁畜牧业的毒瘤，不仅直接影响到畜禽产品生产，同时也降低了产业投入的积极性，转基因家畜在抗病育种方面具有明显的优势。将抗病性基因导入受精卵，发育成的个体就可能表现抗病性。在对各种动物的抗病基因转移研究中，对鸡的抗病效果研究最为显著。美国和日本已用反转录病毒载体法和显微注射法产生了抗马立克和新城疫的新品种鸡。美国农业部以禽白血病病毒 (ALV) 为载体，获得了抗ALV的新品系鸡。我国殷震等将猪瘟病毒抗性基因导入猪体内获得了抗猪瘟猪个体；扈荣良 (1994，1995) 将狂犬
27、病毒糖蛋白的基因导入小鼠，已获得免疫耐受的转基因小鼠，为培养抗狂犬病毒的转基因动物打下了基础。3.3 提高动物的繁育速度 利用转基因动物个体改进常规育种，在转基因兔研究中以转入GH基因和hGRF基因为多见。在提高生产速度和体型方面，Hammer等 (1985) 率先报道了将含有mMT启动因子和人GH基因的融合基因导入家兔受精卵试验，但其转基因子代并没有表现明显的促生长效应。而部分实验表明，外源GH基因可促进转基因兔生长，如和协超等 (1995) 获得的转oGH基因兔体重比对照兔高出1.7倍。转基因动物研究和应用将是21世纪生物工程技术领域最活跃、最具有应用价值的项目之一。它将给人类的医药卫生、
28、生物材料、家畜改良等领域带来革命性的变化，尤其是在乳腺生物反应器生产药物方面，它带来的经济效益和社会效益更是难以估量的。在未来的研究中，转基因动物及其产品必将进入全面产业化和市场化阶段，转基因动物乳腺生物反应器产业将成为最具高额利润的新型行业。在改良家畜方面，转基因技术在新的世纪也将成为培育动物新品种的革命性途径之一。致谢： 天下没有不散的宴席，转眼间一个学期已经接近了尾声。当然动物基因工程这门课也结束了，这半年来，没有伤感，更多的则是遗憾。人生不如意事十有八九，过去的事不能挽回，我们能做的就是带着百倍的信心去迎接明天。所以这段文字既是感激过去又是憧憬未来。 这篇论文所涉及到的知识点大部分都是
29、老师上课讲过的，当热也有一部分是自己在网上以及图书馆查阅的，我希望通过我自己的积累以及努力写出自己满意的东西。论文写起来并不如想象中的容易，为此，我也曾迷茫，失望，甚至想过放弃，但后来想想，做什么事都不是那么轻易就成功的，于是，我便坚持把它写完了。 论文得以完成，与许多人的指导是分不开的，当然，首先感激的还是任课老师闵老师。感谢老师的谆谆教导，细心讲解。同样也喜欢闵老师的上课方式，让我们不仅学到了知识，更是知道了许多与专业相关的常识，这为我们以后的学习生活奠定了很好的基础。感激的同时，我又深感抱歉，因为即便是老师那么深刻的讲解，我还是有些地方不太明白。在此，请老师见谅，也请老师放心，我会加倍努
30、力，不辜负您的深切期望。 千言万语道不尽心中的感激，在此希望那些帮助过我的人万事如意！参考文献：1黄淑帧，陈美珏，黄 英，等. 乳汁中分泌有活性的人凝血因子IX的转基因羊的研制J. 科学通报，1998，48: 783-7842赵淑娟，庞有志，任洪涛，等. 转基因技术与猪的育种研究. 黑龙江畜牧兽医，2004，(4): 65663庞有志，赵淑娟. 转基因技术与鸡的抗病育种J. 中国兽医科技，1999, 3: 43-444卢一凡，邓继先，肖成祖，等. 转基因动物理论与技术的研究进展J. 生物技术通报，1997，4: 175黄俊成转基因猪的研究进展生物技术通讯，1997(6)：586李宁，刘岩，童佳
31、，张然，等. 转基因动物育种研究的现状与趋势. 中国医药生物技术，2009,4(5): 329334英文参考文献：1Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385(6619): 810-8132Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei f
32、rom transfected fetal fibroblasts. Science, 1997, 278(5346): 2130-21333Donovan DM, Kerr DE, Wall RJ. Engineering disease resistant cattle. Transgenic Res, 2005, 14(5): 563-5674Lai L, Kang JX, Li R, et al. Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids. Nat Biotechnol, 2006, 24(4):
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