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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流土壤酞酸酯污染的微生态效应和真菌-植物联合修复技术研究201100522.精品文档.目 录摘要1ABSTRACT3第一章 文献综述51.1 土壤污染概念51.2 土壤酞酸酯污染现状及危害51.2.1 土壤酞酸酯污染现状51.2.2 土壤酞酸酯污染的危害61.3 土壤酞酸酯污染的修复方法81.3.1 物理修复81.3.2 化学修复81.3.3 生物修复91.4 土壤微生物多样性研究方法111.5 论文的选题意义121.6 技术路线12第二章 酞酸酯对土壤微生态的影响研究142.1 试验材料与仪器142.1.1 试验材料142.1.2 试验仪器1
2、52.2 试验方法152.2.1 污染土壤制备152.2.2 土壤基础呼吸测定152.2.3 酞酸酯测定152.2.4 土壤微生物群落多样性测定172.3 结果与分析192.3.1 土壤中酞酸酯含量的变化192.3.2 酞酸酯污染对土壤基础呼吸的影响192.3.3 酞酸酯对土壤微生物多样性的影响202.4 小结25第三章 真菌筛选及对酞酸酯的降解研究273.1 试验材料与仪器273.1.1 试验材料273.1.2 试验仪器273.2 试验方法273.2.1 酞酸酯降解真菌的分离纯化273.2.2 降解能力测定283.2.3 降解条件优化283.2.4 真菌对液体中酞酸酯的降解293.2.5 真
3、菌对土壤中酞酸酯的降解293.3 结果与分析293.3.1降解能力测定结果293.3.2 菌种鉴定结果303.3.3正交试验结果333.3.4 F3液体培养酞酸酯降解结果333.3.5 F3纯菌土壤酞酸酯降解结果353.4 小结36第四章 真菌-植物联合降解研究384.1 试验材料384.1.1 供试土壤384.1.2 植物比选384.2 试验方法394.2.1 试验准备394.2.2 酞酸酯含量和土壤基础呼吸检测394.2.3 土壤DGGE检测394.3 结果与分析414.3.1 酞酸酯对植物的影响414.3.2 酞酸酯对土壤的影响464.3.3 植物对酞酸酯降解的作用484.3.4 微生物
4、对酞酸酯降解的作用494.3.5 真菌-植物联合修复模式初探494.4 小结50第五章 总结与展望515.1 酞酸酯对土壤微生态的影响研究515.2 真菌筛选及对酞酸酯的降解研究515.3 真菌-植物联合降解研究515.4 论文创新点525.5 展望52参考文献53致谢59附录60土壤酞酸酯污染的微生态效应和真菌-植物联合修复技术研究专 业：生态学硕 士 生：郭 杨指导教师：蔡信德 研究员摘要本文以3种国控酞酸酯为研究对象，研究了酞酸酯复合污染的微生态效应，探讨了真菌、植物联合修复酞酸酯复合污染土壤的可行性。研究方法及结果如下：(1) 在实验室模拟条件下，通过测定土壤基础呼吸、PAEs含量、R
5、APD-PCR条带数，研究了邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）和邻苯二甲酸二辛酯（DOP）3种PAEs复合污染对农田土壤基础呼吸、微生物多样性的影响。结果表明：PAEs污染初期的土壤基础呼吸被激活，但这种激活作用随着培养时间的延长而减弱，400 mg/kg组土壤基础呼吸最高。土著微生物对PAEs有一定的降解能力，DEP降解最快，其次为DMP，不同浓度的PAEs对微生物的降解能力有影响。不同处理组土壤微生物群落DNA序列Shannon-Weaver指数顺序为0 mg/kg50 mg/kg100 mg/kg200 mg/kg400 mg/kg。可见，PAEs复合污染提高了土壤基
6、础呼吸，但降低了土壤微生物多样性。(2) 采用3种PAEs复合物梯度驯化，从PAEs污染的农田土壤中筛选出土著降解真菌；通过测定PAEs含量，研究其最佳降解条件和在液体培养基、灭菌土壤中的降解效果。结果表明：筛选出的真菌F2为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporm)，F3为棒束梗霉属(Isaria sp.)。正交试验筛选出最佳试验条件为C:N 20:1和pH 7.0，同时，降解菌在pH 5.0-7.0范围内均可较好的存活。F3可在7天内将液体培养基中300 mg/L PAEs降解66.20 %；30天内将灭菌土壤中300 mg/kg PAEs降解69.02 %。可见，所选菌株对PAEs
7、复合污染物有较好的降解效果。(3) 采用3种PAEs复合污染土壤接种真菌后种植不同根型植物，通过测定植物株高、干重，土壤和植物PAEs含量和土壤DGGE，研究了PAEs对植物生长的影响和土壤、植物中PAEs含量的变化，探讨了建立真菌-植物联合修复模式的可行性。结果表明：PAEs对番茄、大豆的生长均有抑制作用，且对番茄的抑制作用高于大豆，但对香根草生长无影响。添加PAEs、种植植物和接种真菌使土壤基础呼吸和真菌群落发生变化。从DGGE图谱无法判断F3是否存在。土壤PAEs降解是降解菌、土著微生物和植物协同作用的结果。接种F3后可使盆栽土壤中PAEs含量较未接种组平均下降20.67 %，植物中PA
8、Es含量平均下降28.86 %。可见，接种F3后提高了土壤中复合PAEs的降解效率，同时也降低了PAEs在植物内的积累。最后，综合试验结果提出了三种PAEs污染农田土壤的修复模式。关键词：土壤；酞酸酯；微生物；真菌；植物；联合修复Micro-ecological Effects of Phthalate Ester Contaminated Soil and Research of Fungi-plant Combined RemediationMajor: EcologyName: Guo YangSupervisor: Cai XindeABSTRACTThe impacts of com
9、bined phthalate acid ester (PAE) contamination, including dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate (DEP), and dioctyl phthalate (DOP), on soil microbial diversity were studied. The fungi-plant mode of PAEs bioremediation was also discussed. Research methods and results are as follows:(1) The impa
10、cts of combined PAEs contamination, including DMP, DEP and DOP, on farmland soil basal respiration and microbial diversity were studied by monitoring soil respiration, soil PAEs concentration and random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker under laboratory simulation testing. The results showed t
11、hat the soil basal respiration was activated by PAEs at an early stage, reaching a maximum value at 400 mg/kg PAEs treatment. However, this type of activation effect decreased with prolonged PAEs exposure time. In addition, the concentration of PAEs in the soil decreased, especially the DEP concentr
12、ation. The Shannon-Weaver index of soil microbial community DNA sequence in all treatments was: 0 mg/kg 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg. Overall, the results indicated that the combined PAEs contamination in soil may stimulate soil basal respiration, but decrease soil microbial diversity.(2)
13、Two PAEs degradation strains F2 and F3 were isolated from PAEs contaminated farmland soils, and DMP, DEP and DOP could be degraded at the same time by those two strains. The strains were identified as Fusarium oxysporm and Isaria sp. respectively. The optimum C:N of those strains was 20:1, and optim
14、um pH was 7.0. The pH 5.0-7.0 was available for their survival. The biodegradation of PAEs in liquid and soil were studied by monitoring PAEs concentration and mycelium weight. The results showed that the concentration of PAEs in liquid culture medium decreased 66.20% in 7days (initial concentration
15、s 300 mg/kg). The concentration of PAEs in the soils decreased 69.02% in 30days (initial concentrations 300 mg/kg). It is clearly that, those two strains were qualified for the biodegrading of combined PAEs contamination.(3) The degradation of PAEs in farmland soil was tested by monitoring plant bio
16、mass and height, PAEs concentration and DGGE. The fungi-plant mode of PAEs bioremediation was also discussed. The results showed that the growth of tomato and soybean was inhibited by PAEs, but no effect on vetiver. The soil basal respiration and fungi community were influence by adding PAEs, plants
17、 and inoculate fungi. Bands of F3 were no found in DGGE maps at the end of experiment in F3 inoculate soil. Synergistic effect on PAEs degradation was found between F3, indigenous microorganisms and plants. Compare of non-inoculate treatments, the average concentration of PAEs in pot soil was decrea
18、sed 20.67% in inoculate treatments, and the average concentration of PAEs in plants was decreased 28.86% in inoculate treatments. It is clearly that, inoculate F3 enhance the biodegradation of PAEs in soil, and decline the accumulation of PAEs in plants. Three types of PAEs bioremediation mode were
19、suggested.Key words: soil; phthalate ester; microorganism; fungi; plant; combined remediation第一章 文献综述1.1 土壤污染概念土壤污染是指进入土壤的污染物超过土壤的自净能力，而且对土壤、植物或环境造成损害的状况。土壤污染物不是直接进入人体危及健康，而是通过粮食、蔬菜、水果、奶、蛋、肉等进入人体，引发各种疾病，间接地影响人体健康。同时，土壤污染直接影响土壤生态系统的结构和功能，将对生态安全构成威胁1。只有洁净的土壤才能生产出质量安全的农产品，才能保证从田头到餐桌的质量安全。目前，我国土壤和农作物中有毒
20、物质残留问题日趋突出，而土壤污染及其导致的环境质量恶化是农产品有毒物质残留问题的重要原因，但却最易被人们忽视。这是因为与大气和水的污染不同，土壤污染具有隐蔽性、潜伏性和长期性，其严重后果通常只能通过对水环境质量、农产品质量，甚至通过食物链对人体健康产生危害才为人们所察觉2。1.2 土壤酞酸酯污染现状及危害1.2.1 土壤酞酸酯污染现状邻苯二甲酸酯又名酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs)，是由一个刚性平面芳烃和两个可塑的非线性脂肪侧链组成，通常用酞酸酐与各种醇类之间的酯化反应获得。PAEs呈无色油状粘稠液体，常温下蒸气压很低，难溶于水，不易挥发，其比重与水相近，难燃烧，凝
21、固点低，易溶于有机溶剂和脂类，具有相当宽的液态温度范围和很大的流动性。这些特殊的物理化学性质决定了PAEs的特殊环境行为3。作为性能良好的增塑剂，PAEs在建材、汽车、家居、包装和医药等行业都有应用，也用作农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂、合成纤维纺织品、抛光剂等的原料。PAEs在材料内部没有与树脂形成共价键，较易从制品向外环境转移，广泛存在于水体、土壤及空气中4,5。在塑料地膜中PAEs的含量仅次于塑料本身，它们彼此之间由氢键和范德华引力结合，保留了各自相对独立的化学性质。因此，这种材料的稳定性相对较差，PAEs易从塑料地膜中渗出，污染土壤6。而塑料地膜以其质轻、透光、保温、保湿性好
22、，不仅在我国北方广泛使用，而且在年均气温较高的南方，也被广泛应用于早稻、棉花、西瓜地覆膜育秧和冬季暖棚蔬菜生产之中。我国地膜应用已经有20多年的时间，每年应用量近百万t，覆盖面积达1000多万hm2，覆盖作物达40多种，随着地膜老化、破碎和回收不净，农田PAEs残留日益严重。塑料地膜技术的应用一方面极大促进了我国农业的发展，另一方面随着地膜应用量和使用年限的不断增加，大量残留地膜造成的污染也严重影响了农业生产的进行，而且对农业环境的安全与健康也构成了巨大的威胁7-9。对珠三角地区的研究10,11表明，珠三角城市中东莞土壤中的PAEs含量最高，平均达3710 g/kg；比居于次位的深圳高3倍；惠
23、州土壤的PAEs最低，为600 g/kg；中山与惠州接近，为715 g/kg；珠海与深圳基本含量相近，为1000 g/kg左右。各地土壤中的PAEs均值高低顺序依次为东莞深圳（珠海）中山（惠州）。菜园土壤中的PAEs平均含量相对比果园高37 %左右，这可能由于菜园土壤使用农膜量相对果园大。深圳菜园和果园土壤的DEP，DnP，BnBP和DEHP含量较高，在65-277 g/kg之间，其中菜园土壤的DEP含量最高。蔡全英等12的研究表明，广州地区蔬菜生产基地中PAEs化合物总含量在3.00-45.67 mg/kg之间，其中37 %样品的PAEs化合物总含量在10-20 mg/kg，22 %样品的P
24、AEs化合物总含量在20-30 mg/kg，与美国PAEs控制标准相比，DMP，DEP，DnBP，BBP，DEHP均不同程度超标。1.2.2 土壤酞酸酯污染的危害1.2.2.1 酞酸酯对土壤微生物的影响土壤微生物是土壤的重要生命体，是土壤污染的敏感指示物13。当大量PAEs进入土壤环境中，土壤微生物群落的数量、结构和多样性都会受到影响，最终使土壤生态系统的功能受到损害14-16。谢慧君等14的研究表明，土壤PAEs含量越高，对微生物代谢活性的抑制作用越大。低浓度PAEs污染土壤中微生物以糖类和羧酸类代谢群为优势类群，而中浓度和高浓度PAEs污染土壤中微生物以多胺类代谢群为优势类群。PAEs的投
25、加刺激了土壤中某些特异菌种的出现，使群落遗传多样性发生变化。陈强等17的研究表明，DEHP对土壤微生物有一定抑制作用，DEHP对微生物产生影响的最低可见效应浓度为10 mg/kg干土。土壤高浓度邻苯二甲酸二丁酯（DBP），邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP）污染，对微生物生物量碳、土壤基础呼吸以及过氧化氢酶活性均表现抑制效应，抑制作用随处理浓度的增加而加强18。DEP也可以降低土壤微生物的多样性19，其中可培养细菌种类可降低47 %，假单胞菌可降低62 %，这可能是由于其亲脂性破坏了细胞膜20。1.2.2.2 酞酸酯对植物的影响PAEs在植物体中有较强的富集作用，甚至在它们的深加工产品中都发现了PA
26、Es的存在21。胡萝卜、白菜、西红柿、大豆、水稻、绿豆、柽麻中都有PAEs检出22；在数十种柠檬油、橙子油和桔子油中也能检测出不同浓度的PAEs23。王曙光等24的研究表明，在土壤添加100 mg/kg DBP时，豇豆地上部分DBP含量可达到15 mg/kg。植物根系对DBP有较强的吸收或吸附性，根系中的DBP浓度远大于土壤施加浓度，这可能是DBP(甚至是PAEs系列化合物)对植物的危害所在。秦华等25的研究表明，绿豆将DEHP向地上部转运时，主要分配在豆荚中，其在豆荚中的含量远远高于茎叶中的含量。由于与土壤直接接触，并且是植株吸收营养的主要部分，绿豆的根系中DEHP含量普遍较高。PAEs也在
27、一定程度上影响作物的产量和品质。DBP和DEHP对蔬菜幼苗期生长有一定的障碍作用，且DBP对作物生长的影响比DEHP更为突出；2种PAEs均影响蔬菜产量，使部分品种蔬菜可食部位的Vc含量降低21。DBP使蔬菜的减产幅度在12.8 %-60 % 26。虽然DBP相对易降解，但其易被富集、迁移速度较快的性质，无疑增加了其对作物造成污染的几率24。土壤DBP和DEHP污染后，豇豆地上和地下部分干重均有不同程度下降，高浓度DBP和DEHP还使豇豆叶绿素a和b的含量及根瘤数降低。随着DBP和DEHP浓度的增加，叶绿素含量逐渐下降，10 mg/kg时，豇豆叶绿素a含量比空白下降8.6 %，叶绿素b含量比空
28、白下降13.3 %；50 mg/kg时，豇豆叶绿素a含量下降23.5 %，叶绿素b含量下降26.7 %27。1.2.2.3 酞酸酯对动物及人的影响现有资料显示，PAEs的急性毒性不大，Ames试验呈阴性反应，但在大剂量的情况下，对动物有致癌、致畸和致突变性28,29。高丽芳等30用DEHP对小鼠胚胎进行试验，结果显示DEHP可导致胚胎形态发育异常，主要表现为骨骼、心血管系统、眼和神经管畸形。大鼠试验中，雄性大鼠出现输精管萎缩退化，精细管破坏，睾丸和附睾退化，睾丸发育不全，出血性睾丸，尿道下裂等现象31,32；雌性大鼠出现抑止或延迟排卵，抑止雌二醇生成，多囊卵巢等现象33。PAEs对动物的生化效
29、应主要表现为过氧化酶体增生、足细胞毒性、肝脏促进作用、抗雄激素等，对啮齿类及其它动物的整体效应表现为肝癌、睾丸萎缩、尿道下裂、ER配基、细胞增生等34。PAEs进入食物链后还存在生物放大现象35。聂湘平36等报道了水中添加DMP，DEP，DBP和DEHP 4种PAEs后种植龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)，并用龙须菜喂养篮子鱼(Siganus oramin)的试验。结果显示龙须菜植物对DEHP有较高的积累，篮子鱼的不同组织对4种PAEs都有一定程度的积累。其中DBP和DEHP在鱼内脏组织中有较高的积累和分布，其次为鱼残体组织，肌肉组织中含量最低。侧链烷基基团较长、较复
30、杂的PAEs较侧链较短的PAEs更易在鱼体内富集。PAEs沿龙须菜-篮子鱼食物链传递过程中存在生物放大现象。DEHP对蚯蚓生长的可见效应浓度(LOEC)为0.005 g/kg干土，蚯蚓对于0.005 g/kg干土的DEHP富集倍数为7.3217。对我国人群DBP暴露状况的调查37结果显示，DBP广泛存在于环境和人体生物样品中，估计每日总摄入量为14.8 g/(kgd)，食物是其主要的摄入途径，占总摄入量的90.2 %。由此可以推测，人类通过皮肤、呼吸、食物链等途径长期接触环境雌激素PAEs，可对人体造成慢性危害，主要表现为生殖毒性38,39。PAEs可能导致人类肢体畸形、内分泌失调、生殖系统病
31、变，精子数量减少，乳腺癌发病率升高等不良后果，而且可以通过胎盘和授乳产生跨代影响40。总之，邻苯二甲酸酯类对人类和其他生物都存在潜在危害。1.3 土壤酞酸酯污染的修复方法1.3.1 物理修复PAEs的物理修复主要采用高比表面积的吸附剂等材料4。Whittaker等41指出活性炭能够高效地吸附废水中的PAEs；Wang等42利用细菌菌体的生物吸附去除DBP。虽然吸附法能有效去除PAEs，但PAEs并未转化为无毒物质，对环境依然存在潜在风险。1.3.2 化学修复PAEs的化学修复主要通过臭氧氧化和紫外光解等方法实现。施银桃等43进行了水溶液中DMP的臭氧氧化研究，考察了pH值、温度、臭氧用量等对氧
32、化结果的影响。结果表明，臭氧氧化可降解水体中的DMP，毛细管电泳(CE)分析证明有邻苯二甲酸等中间产物产生。臭氧氧化的效果与臭氧浓度和反应时间成正比；DMP去除率随pH值的升高呈上升趋势；加入催化剂Mn()可大大提高DMP的去除率；16-27 的温度条件有利于反应进行。刘芃岩等44研究了PAEs在紫外光下的降解过程，结果表明PAEs的紫外光解符合一级反应动力学，反应速率常数随PAEs浓度的增大而增大。PAEs的降解从侧链开始，光照产生的羟基自由基攻击苯环和侧链酯基相连的CC键，随着CC键的断裂，PAEs被逐步分解为小分子，主要的中间产物为苯甲酸单酯。UV/H2O2联用工艺对水中DMP的去除效果
33、较好。DMP的去除效率随H2O2投加量的增大而增大，但H2O2增大到20.0 mg/L以上时，去除率有所降低。pH值的变化不会影响H2O2对DMP的氧化降解。TiO2为催化剂的紫外光解也符合一级反应动力学。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的紫外光解反应从侧链开始，苯甲酸是主要的降解产物之一；邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)的紫外光解反应首先发生在苄氧基，降解中存在中间产物的重排过程；邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)的催化光解存在两种可能的途径，其一是环己氧基羰基发生断裂，环己氧基羰基作为离去基团；另外一种断裂方式是环己氧基断裂45。虽然PAEs在自然条件下可发生化学水解反应，但半衰期很长，由微生物酶催化
34、的水解等反应才是其在环境中降解的主要途径8。1.3.3 生物修复1.3.3.1 细菌降解研究微生物降解被认为是PAEs完全矿化的主要途径。近年来，PAEs的细菌降解已得到广泛研究，大量高效降解菌株已从各类环境中分离得到，包括红树林、土壤、海洋、河流与废水处理厂的活性污泥等46-52。秦华等53从化工厂活性污泥中分离得到一株纤维单胞菌属（Cellulomonas sp.）细菌，可高效降解DEHP。李俊等54从垃圾填埋场土壤中分离得到深红红球菌(Rhodococcus ruber) ，可高效降解DBP。张付海等55从巢湖底泥中筛选出皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)
35、 ，可同时降解DMP、DEP、DBP和DEHP。段星春等56采用水-硅油双相体系从污染土壤中驯化得到两株细菌乙酸钙不动杆菌属(Acinetobacter calcoaceticus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，能够以DBP为惟一碳源和能源生长，两株菌可在48 h内将初始浓度40 mg/L的DBP分别降解98.64 %和74.62 %。李魁晓等57从红树林底泥中驯化得到PAEs降解菌Rhodococcus rubber 1k，在好氧条件下可将邻苯二甲酸二甲酯（DMP）快速降解，5 d内将初始浓度50 mg/L的DMP完全降解。细菌对PAEs的降解主要由邻苯二甲
36、酸酯酶和原儿茶酚双加氧酶参与，经由邻苯二甲酸单甲酯(MMP)，邻苯二甲酸(PA)和原儿茶酚途径降解，原儿茶酚通过正位开环完全降解为CO2和H2O58,59。1.3.3.2 真菌降解研究与细菌相比，真菌降解PAEs的报道较少，主要包括利用真菌产生的纯酶试剂进行降解和纯培养真菌进行降解两方面46。纯培养真菌降解PAEs的研究最早报道于1991年，Sclerotium rolfsii可将对苯二甲酸二甲酯(DMTP)经由对苯二甲酸单甲酯(MMTP)转化为对苯二甲酸(TPA)，但TPA是其代谢终产物，进一步的降解没有发生60。Ganji等58报道Aspergillus niger可以完全降解DMTP，它
37、可将DMTP转化成MMTP，TPA和原儿茶酚，最后原儿茶酚偏位开环完全降解为CO2和H2O。Pardeepkumar等61报道了A. niger可降解DMP。Chai等62测试了14种真菌对DEHP的降解能力，其中9种真菌可在液体中将初始浓度为40 mg/L的DEHP降解50 %以上，镰刀菌属真菌可将DEHP降解98 %以上。Lee等63测试了液体培养条件下3种白腐真菌Phanerochaete chrysosporium，Trametes versicolor和Daldinia concentrica对DBP的降解能力，D. concentrica和T. versicolor对DBP的降解速
38、度较快，在初始浓度为28 mg/L时，6 d可将DBP完全降解。1.3.3.3 真菌-植物联合降解研究利用植物降解PAEs的报道还较少，Cai等64报道水菠菜（Ipomoea aquatica）对DBP有一定降解能力。真菌-植物联合降解PAEs的报道也较少。土壤PAEs污染对丛枝菌根真菌（AM）化植物影响的报道较多。AM可以促进PAEs在土壤中的降解、降低其在植物中的残留65。豇豆接种AM后，促进了DBP，DEHP在土壤中尤其是菌丝际土壤中的降解，同时减少了DBP和DEHP在豇豆体内的残留24，说明AM的菌丝在PAEs降解和转移过程中起了某些特殊的作用。AM可以抑制豇豆对DEHP的吸收或向地上
39、部分的转运，降低豇豆地上部分DEHP的浓度66。对绿豆进行AM和DEHP降解细菌双接种，能在DEHP降解过程起到最大的协同作用，同时也能减少DEHP在绿豆地上部分，特别是豆荚中的累积67。AM减少植物体中有机污染物累积的机理可能是：AM改善了磷素营养供给，改变了细胞膜的通透性，从而影响植物对有机污染物的吸收和利用；AM特殊的结构如泡囊、根外附着胞等的酯性物质含量高，增加了对有机污染物的固定和吸附，改变其在植物体内的分布和迁移，从而缓解了根系遭受毒害的程度；AM还可能直接降解和利用有机污染物，并将其转化为自身和宿主的养分源，降低土壤污染程度和植物毒害程度；AM自身产生或刺激植物产生一些特殊的酶类
40、，加速土壤中有机污染物的降解25,68。1.4 土壤微生物多样性研究方法土壤微生物多样性研究方法包括基于传统生物、化学的方法和基于现代分子生物学的方法。生物、化学方法包括平板计数、荧光染色、Biolog微平板、磷脂脂肪酸(PLFA)谱图分析等。分子生物学方法包括基于分子杂交技术的分子标记法，如荧光原位杂交(FISH)、同位素标记技术等，可对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性；基于PCR技术的方法，如随机扩增多态性DNA技术(RAPD)、扩增片段长度多态性技术(AFLP)、限制性片段长度多态性技术(RFLP)和末端限制性片段长度多态技术(T-RF
41、LP)、单链构象多态性技术(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)、核糖体基因间区分析(RISA)等，可以将极微量的DNA进行大量扩增，通过比较分析基因序列的特异性来研究微生物的多样性；基于DNA序列测定的方法，如元基因组(metagenome)测序技术等，是难培养微生物或不可培养微生物的系统发育和功能研究的重要方法69。由于不可培养微生物的存在和试验精度等限制因素，传统生物、化学方法在研究土壤微生物多样性时，相比分子生物学方法有局限性。目前，DGGE技术已应用于PAEs污染土壤微生物多样性研究。Kapanen等19利用DGGE技术研究了DEP对土壤微生物多样性
42、的影响，结果表明投加高浓度DEP（10, 100 g/kg）可使土壤微生物多样性明显下降，这可能由于DEP的生物有效性和毒性抑制了多数微生物的种群数量，只有少数降解微生物种群增加。Chao等70的研究表明，土壤投加DEHP后，微生物群落多样性也受到影响，土著DEHP降解菌的种群数量增加。1.5 论文的选题意义全世界每年的PAEs产量高达数百万t71。PAEs已广泛存在于环境之中。而土壤是环境中PAEs存在的主要介质之一，因此修复农田土壤PAEs污染对保护我国农田土壤质量，保障农产品安全、生态安全和人体健康具有十分重要的现实意义。目前，生物降解PAEs的研究多见降解细菌的筛选和纯培养降解效果等报
43、道，同时接种菌根真菌降低PAEs对植物胁迫的报道较多，而筛选降解真菌的报道较少。以单一PAE为降解对象的报道较多，而以PAEs复合物为降解对象的报道较少。因此，本论文在研究PAEs复合污染土壤的微生态效应的基础上，从PAEs污染的农田中筛选可同时降解3种PAEs的土著降解真菌，测试其最佳的降解条件，并将其应用于PAEs复合污染土壤的修复，为PAEs污染土壤的生物修复提供依据。1.6 技术路线本论文的技术路线为：国内外相关文献收集、分析成果总结、形成论文土壤微生态研究植物比选污染土壤采集菌种筛选及降解条件优化真菌-植物联合修复研究土壤呼吸微生物多样性土壤PAEs含量变化纯菌降解土壤中PAEs试验
44、植物生长土壤PAEs含量土壤呼吸植物PAEs含量真菌-植物联合降解模拟土壤DGGE第二章 酞酸酯对土壤微生态的影响研究PAEs是环境中常见的有机污染物72,73，具有内分泌干扰毒性和生物累积性74。PAEs污染不但影响农田土壤质量，而且影响土壤微生物的数量和多样性，进而影响生态系统功能9。目前土壤DEP, DBP, DOP, DEHP单一污染对微生物影响的报道16-18,75较多，而复合污染对土壤基础呼吸以及对土壤微生物多样性方面的报道还较少。本章采用室内模拟试验，结合土壤呼吸、GC检测和RAPD-PCR技术，在恒温、避光条件下研究了DMP, DEP, DOP复合污染对农田土壤基础呼吸和土壤微
45、生物群落多样性的影响，为PAEs污染土壤的健康风险评估提供科学依据。2.1 试验材料与仪器2.1.1 试验材料试验用土壤取自华南农业大学农场水稻田耕作层，经风干、碾碎后过5.0 mm筛。土壤指标：有机质2.32 %，TN 0.10 %，TP 0.073 %，TK 2.00 %，pH 5.56，质地为中壤土。DMP，DEP和DOP（分析纯）均购自天津市大茂化学试剂厂，取3种PAEs溶于丙酮，制成5 g/L储备液，冰箱4 保存。3种PAEs标样购自环境保护部标准样品研究所，规格2 mL 1000 g/mL。无水硫酸钠（分析纯），丙酮、正己烷(色谱纯)，氧化铝(100-200目)，硅胶(80-100
46、目)。PAEs提取和分析过程中所接触的所有玻璃器皿都必须先用洗液(重铬酸钾:浓硫酸:水=20 g: 360 ml: 20 ml) 洗涤，置300 烘箱过夜，冷却后用色谱纯丙酮和正己烷淋洗，使用前风干；硅胶用色谱纯丙酮超声萃取20 min，130-140 下烘4 h备用；无水硫酸钠于马福炉550 烘4 h，冷却备用；氧化铝于马福炉250 烘12 h，冷却备用；色谱纯丙酮、正己烷检测空白值。RAPD-PCR试验材料及来源如下：十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、TrisBR十二烷基硫酸钠（SDS）AR醋酸钾、磷酸钠、异戊醇、异丙醇AR蛋白酶k、溶菌酶Bio Basic Inc.柱式腐殖酸清除剂上海生
47、工生物工程有限公司Taq酶、10Buffer、dNTP上海生工生物工程有限公司RAPD系列引物（SBS A）北京赛百盛基因技术有限公司100 bp DNA LadderFermentasGelRed核酸染料Biotium2.1.2 试验仪器2250试验室土壤呼吸系统（ADC），GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems），GBox chemi HR凝胶成像系统（Syngene），Heraeus Multifuge 1S-R离心机（Thermo），BG-subMIDI 水平电泳仪配BG-power300电源（Baygene），HP1000S型生化培养箱（武汉瑞华仪器设备有限公司），GC-17A气相色谱仪（日本岛津公司），KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），RE-52旋转蒸发器（河南省巩义市英峪仪器厂）。2.2 试验方法2.2.1 污染土壤制备取少量过0.3 mm筛的土壤加入5 g/L PAEs储备液，使各PAEs浓度均达到1000 mg/kg（总浓度3000 mg/kg）。待丙酮挥发，取适量上述土壤与未污染土壤混合制成5个浓度的污染土壤，PAEs浓度分别为0，50，100，200和400 mg/kg（PAEs的总浓度分别为0，150，300，600，12