分子生物学课件6.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流第六章第七章第八章第九章 分子生物学课件6.精品文档.第十章 RNA转录 (RNA transcription)第一节 转录概述一、基本概念转录(transcription)：是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶催化下，以4种NTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。 以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板(转录的不对称性！)有义链 sense strand 编码链 coding strand: 指不作模板的DNA单链 反义链 (antisense strand) 模板链 templa

2、te strand: 指作为模板进行RNA转录的链 5-ATGAGTA-33-TACTCAT-5DNARNA 5-AUGAGUA-3模板链并非永远在同一条单链上 转录单位：起始点终止子。转录起点: 1，上游记为负值，下游记为正值 一个转录单位可以包含一个以上的基因初级转录体(primary transcript )：转录的最初产物。二、 转录泡 DNA链分开形成转录泡。以DNA一条链为模板按碱基互补配对原则合成RNA。 当RNA聚合酶结合到启动子上时，转录泡形成。当RNA聚合酶沿着DNA移动时，转录泡也随之移动，其后的DNA双链体重新形成双链旋。同时RNA链逐渐增长。 三、转录阶段：promo

3、tion, elongation, termination 三过程 第二节 原核生物RNA转录的起始 (RNA Transcription promotion in prokaryots) 一、原核生物的RNA polymerase (E. coli) 1、全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme) 此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能 （1） 因子 使 Holo-enzyme识别Sextama Box, 与模板链结合 修饰 RNApol 构型，降低全酶与DNA的非专一性结合力（107/mol）增强全酶与R, B site的专一性结合力 (101

4、4/mol)亚单位被认为与启动子识别特异性相关 因子与核心酶之间可逆结合因子或者在起始之后被释放，或者改变和核心酶的结合使得它不再参与DNA的结合。由于因子的数量少于核心酶，所以核心酶需要因子的循环再利用（2）因子 核心酶的组建因子 + 2+ + 促使RNApol与DNA 模板链上游转录因子结合 位于前端的因子使双链解链为单链 位于尾端的因子使单链新聚合为双链 在启动子识别中起作用。（3） 因子 促进RNApolNTP RNA elongation 完成NMP之间的磷酸酯键的连接 Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基） 与Rho （）因子竞争RNA 3- end 构成Holoenzy

5、me 后，因子含有两个位点I site（initiation site . Rifs）： 该位点专一性地结合 ATP或者GTP （需要高浓度的ATP或GTP）E site（elongation site RifR）：对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing功能） （4） 因子参与RNA非模板链（sense strand）的结合充当SSB） 由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点 有义DNA链结合位点（ 亚基提供） DNA/RNA杂交链结合位点（亚基提供） 双链DNA解链位点（前端 亚基提供） 单链DNA重旋位点（后端亚基提供） 因子作用位点Rifampin对RNApol 的抑制表

6、现 Rif紧密与亚基结合Rif 与A/GTP对I site的竞争 阻止 ATP/GTP对I site 的填充 当I, E site被pppXpY(2NMP)填充， Rif 能阻止RNApol的前进 当I, E site被pppXpYpZ(3NMP)填充， Rif失去抑制效应 Rifampin是RNA合成起始的抑制剂 二、 Promoter 的结构与功能 ( Prok. E.coli ) rrnB P1 promoter 1. 核心启动子（1） Sextama 框（Sextama Box） -35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点， RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点识别位点（R位点） 大多

7、数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol 的因子） 位2） Pribonow 框（Pribonow Box） -10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点（B 位点） 一致序列：T80A95T45A60A50T96 （TATPUAT） 位置范围 4 到13（3）起始位点 ; +1 RNA transcriptional startpoint (I site) A/G4）-35和-10序列的间距 在90%的启动子中，-35区和-10区之间的分隔距离在1618之间。 2、 CAP-cAMP 结合位点 （也称CAP位点） 转录

8、调控中，I 阻遏蛋白 负调控 lac 操纵子模型 许多基因的表达还存在正调控机制 例如: E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时 只有葡萄糖被 利用 原因：CAP位点的正调控 葡萄糖缺少时 ，腺苷酸环化酶将ATP cAMP， cAMP与CAP位点结合,此时启动子的进入位点才能 与RNApol结合 葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有CAPcAMP 与CAP位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结 合RNApol （1）CAP位点的组成 （70 40） 位点：70 50 包括一个IR 序列 强结合位点 位点：50 40 弱结合位点 位点对位点具有协同效应（cooperativity） （2

9、） 位点结合CAPcAMP复合物后，促使RNApol进入 Sextama Box,最终与10序列结合起始转录 原因：CAPcAMP复合物与位点结合 Sextama Box 富含GC区域（GC岛区）稳定性降低 Pribnow Box 的溶解温度降低 促进开放型启 动子复合物的形成 促进转录 三、起始过程 封闭型启动子复合物- 开放型启动子复合物 - 第一个磷酸二酯键-因子解离 四、 大肠杆菌不同的 因子对转录的调控当 37时；大肠杆菌利用正常的70因子启动转录当 37时;RNA聚合酶利用32因子识别17种与热应激蛋白相关的基因启动子特异序列每一套启动子的共有序列是不同的，无论是位于- 35 区和

10、- 10 区的。这就意味着一个聚合酶包含特定因子，仅识别它自身的一组启动子，因此不同类型的转录可分别进行。第三节 真核生物RNA转录的起始RNA Transcription promotion in Eukaryots一、真核生物的RNApol1、 三种RNApol： 根据对 - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感 （动、植、昆） RNApol 最敏感 RNApol 不同种类的敏感性不同 2、 位置和转录产物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 转录rRNA（5.8S、18S、 28S） RNApol 核质 主要负责 hnRNA、snRNA 的转录 hnRNA（mRNA 前体

11、，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA） snRNA（核内小分子 RNA small nulear RNA) RNApol 核质 负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和 部分 snRNA 目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNApol（活性较低） 3、聚合酶亚基组成： 分子量500KDa 包括： 2个大亚基L, L 712个小亚基 3、聚合酶亚基组成：RNApol： 大亚基中有 C 末端结构域 (carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer C 端重复七肽 不同生物中

12、重复数目不一样（酶活性） （酵母重复26次，鼠重复52次 ） CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被称为o 非磷酸化的 RNApol 称为a CTD参与转录 a o 使 RNApol易于离开 启动子进入延伸过程（10倍） 二、 真核生物的启动子 三种 RNApol 三种转录方式 三种启动子 三类基因，类 类 类 1、 RNApol的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成 （1） 帽子位点（cap site）：转录起始位点 与Prok.的“CAT模式”相似 （2） TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框） 位

13、于30(-25-35bp)处 一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37） 定位转录起始点的功能 （类似原核的Pribnow框） TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的 通用型启动子（无组织特异性） （3） CAAT框（CAAT box） 位于75bp（-70-80）处 一致序列为GGC/TCAATCT 前两个 G 的作用十分重要(转录效率) 增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性 （距转录起始点的距离，正反方向） 以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在 （4） 增强子（enhancer） （又称远上游序列 far upstream sequence）

14、 该增强子的特点如下： 增强子是通过启动子来增加转录的 对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖 的情况 距离效应: 离72bp越近的容易起始转录 无位置和方向性 细胞类型的选择：不同类型中作用有差异 表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白） 基本的核心顺序(core sequence)： AAAGGTGTGGGTTTGG （6）其他元件（不讲） 八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件） 一致序列为 ATTTGCAT KB元件 一致序列为 GGGACTTTCC ATF元件 一致序列为 GTGACGT 还有一些位于起始点下游的相关元件（7） 不同元件的组合情况 不同元件

15、的数目、位置、和排列方向均有差异 例如：SV40的早期启动子中有6个GC框小结： 不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同 不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交 启动子功能没有变化 各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上， 组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定 了转录的起始三、 真核生物转录的起始 三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力 转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子)参与,并且按一定顺序与DNA形成复合物,协助RNApol定位于转录起始点TFIIA; 结合 TFII D 促进 TFII D 结合到 TATA box 稳定 DNA-TFII D 复合体 TFII

16、B; 一旦TFIID 结合到 DNA TFIIB 结合到 TFIID的TBP 和 RNA pol. II TFIIB 充当桥梁因子，使RNApol II 与TFIIF的 RAP30亚基一起组装TICTFIIF; 包括 RAP30, RAP74两个亚基 结合RNApol II 组装成 TIC 通过其螺旋酶性质(ATPase)促进 RNA 延伸第四节 转录延伸 Transcription Elongation 一、 起始到延伸的转变 始于第一个磷酸二酯键的形成 伴随着DNA分子和酶分子构象的变化 1、Prok. 起始时， 因子有利于 和 亚基具有与DNA专一 性结合所要求的构象 起始后, 因子解离

17、, 和 亚基构象发生变化 2、 Euk. 多种辅助因子的共同作用来保证这一转变二、 延伸过程（Prok） 酶与产物RNA不解离 底物NTP不断加到RNA链的 3-OH 端 形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动 延伸位点不断地接受新的NTP，RNA链不断延伸 始终保持三元复合物的结构1、 转录泡 RNApol 结合和转录的DNA模板区域，有17bp左右 DNA形成解链区 转录泡处杂交双链很短 胰脏 RNAase_其长度10bp（不准确） 推测也就两个核苷酸左右2、 拓扑学问题 RNA合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变 RNApol 的前沿.解螺旋作用 RNApol 后端.DNA的螺旋化 （保持

18、解链区长度约17核苷酸左右） 超缠问题的解决靠DNA旋转酶 RNA-DNA杂交链也要求作旋转运动3、 转录过程中的延宕 （1） RNA的合成速度大约 30 50 个核苷酸 秒,与蛋白质的合成速度相近(15个AAsec) （2） 模板DNA中GC 的存在 （GC后的 810 个核苷酸） 延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用思考: 延宕发生的原因?第五节 转录的终止 Transcription termination 终止过程： 酶停止添加底物释放RNA链酶解离 终止反应杂合双链的氢键断裂， 重新形成双螺旋，酶的解离。 终止子（terminator）：在转录的过程中，提供转录终止 信号的RN

19、A序列 真正起终止作用的是RNA序列与启动子不同 Prok.和Euk. 都具有一种基因表达调控的手段一、原核生物的终止子 1、 终止子的种类 （1） 内在终止子（不依赖 因子的终止子） 体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止 （2） 依赖因子的终止子 蛋白质辅助因子因子存在时，核心酶终止转录 两者有共同的结构特征（序列差异）终3、依赖 因子的终止子（Rho-dependent terminator）止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度 效率 a)Structure 回文序列 G/C 含量少，形成松散的RNA 发夹结构 DNA水平上，回文序列之后是 一串的A/T结构转录终止需因子

20、二、 原核生物转录的终止 1、不依赖因子的终止子终止转录 （1） 新生RNA链发夹结构形成-与RNApol发生作用-阻止RNA链的释放-造成高度延宕（典型的有60秒左右）（2） RNApol暂停为终止提供了机会 ，6 8个连续的U 串可能为RNApol与模板的解离提供了信号 RNADNA之间的 rUdA 结合力较弱 于是： RNADNA解离 三元复合体解体 RNApol解离 转录终止（3） 真正的终止点不固定，在 U串中的任何一处（4） IR序列和U串同等重要 IR中的GC对含量的减少 U串的缩短或缺失（5） DNA上与U串对应的为富含AT的区域 说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的

21、作用2、依赖 因子的终止子终止转录（1）终止子上游有一个RNA 富含C 残基而G 残基很少的区域（2） 因子a、 活性形式为六聚体 含有RNA-binding domain和ATP hydrolysis domainb、 RNA长度大于50nt时，依赖RNA的 ATPase活性最大说明：因子识别和结合的是RNA（3） 因子对终止子的作用 （4） 终止反应还需要 RNA 与 DNA 的相互作用 即 ： 需要一定的RNA序列 因为： 其与模板的结合力必须弱到一定数值，才能配合 因子与 RNApol 的作用 （发夹结构下游的AU序列） 序列不同的终止子不同的终止程度基因表达 调控的途径之一（5） Prok.依赖因子的终止子为基因表达调控 提供了一种方式 因为： Prok.中转录与翻译偶联 ？为什么同一个转录元里近基因的一个无义 突变能阻止远基因的表达这一极性现象三、 真核生物的终止子及转录终止 了解很少（3 末端） 1、 RNApol的终止子类似Prok.不依赖因子终止子， 终止可能靠RNApol本身完成 SV40的终止子: 发夹结构 U串 2、 RNApol的终止子类似原核生物（发夹结构 U串） U串位于发夹结构的顶端 且保守性很强（酵母人） 环和柄对转录的终止同等重要