免疫细胞化学技术.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流免疫细胞化学技术.精品文档.免疫细胞化学技术免疫细胞化学，与免疫组织化学（Immunohistochemistry）相同，它 是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytoc

2、hemistry)。抗原和抗体的要求 具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。 对抗体的要求：纯度高、比活性强； 高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。 对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。抗原 (antigen, Ag) 抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性： 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性； 免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 根据抗原是否显示免疫原性分为： 完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。 免疫原性最强的是蛋白质抗

3、原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载 体 通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小

4、肽。（三）抗体 (antibody, Ab)1、抗体的概念： 免疫球蛋白 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。 抗体主要存在于血清内； 抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。 单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 特异性强、抗体产量高。 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产

5、生的抗体混合物。 特异性低，会产生抗体的交叉反应。 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。3、抗体的制备多克隆抗体的制备 动物的选择 佐剂(adjuvant) 免疫方法 免疫剂量 抗体效价的测定 放血或定期抽血(1) 动物的选择选择什么动物来免疫取决于： 所需抗血清的量 小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。 能供免疫用的抗原量 小鼠50mg足够，而山羊需要几毫克。(1) 动物的选择(续) 动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。 例如哺乳动物的抗原可选择非

6、哺乳动物来制备抗体。 常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。(2) 佐剂 (adjuvant) 一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。 最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为: 弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant) 弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant)弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant, FIA) 是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或T

7、ween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。 使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA) 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为220mg/ml)，即成为FCA。 免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法 研磨法：适于制备大量的佐剂抗原 先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓

8、缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。 按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。 缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法(续) 注射器混合法 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。 优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。 缺点：不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法(续) 快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超

9、声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。 每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心510min收集。 优点：简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定 判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。(3) 免疫方法免疫途径 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。 一般采用多点注射方法 常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。 皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。(3) 免疫方法免疫途径

10、 (续) 几点说明： 大动物一般不用腹腔注射 颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射 抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100mg抗原即可获得较好的免疫效果。 皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。(3) 免疫方法次数及间隔时间 次数一般为23次(初次免疫和加强免疫) 首次注射后，1015天再加强注射； 剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。 间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长 豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天； 第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1：家兔的免疫 初次免疫 用50200mg Ag加入FCA，在背部皮下注射68点，每点0.10.2ml，

11、也可肌肉内或皮内注射； 两周后，加强免疫 将50200mg Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射； 抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血 抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔 一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔 先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)； 10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化； 以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各

12、次注射的抗原均为2550mg； 末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。举例3：豚鼠和大鼠的免疫 初次免疫 用10100mg Ag加入FCA，在背部皮内注射46点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射； 加强免疫 每隔 78天，将1050mg Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射； 抗体效价的检测(4) 免疫剂量 抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制； 免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。(4) 免疫剂量 (续) 各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量(5) 抗体效价的检测多采免疫双向扩散法【基本原理】 指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特

13、异性的沉淀线。 将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。 优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。免疫双向扩散法的操作步骤 将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。 将l % agar 融化后，置56C水浴。 在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。 中心孔加5ml 抗原样品，周围孔内每孔加5ml 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。 凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。 观察结果。抗体效

14、价检测的其它方法 环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用； 对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用； 酶联免疫吸附试验 (ELISA)。(6) 放血或定期抽血常用以下3种方法 颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。 心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。 静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。(6) 放血或定期抽血 (续) 采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血 血液凝固后，及时离心收集血清，否则

15、细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价； 加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。 标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件 免疫组化对组织和细胞标本的要求 保持所检标本原有的结构、形态； 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。 免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本 组织标本 石蜡切片 冰冻切片 细胞标本

16、组织印片 细胞培养片(细胞爬片) 细胞涂片石蜡切片 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法 最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察； 石蜡块还能长期存档，供回顾研究。 石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事项 标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。 取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。 细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而

17、且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。1、取材的特殊要求及注意事项(续) 避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃； 镊取组织动作要轻； 经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。2、固定及常用的固定液 取材后的组织需立刻投于固定剂中 固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态； 对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。 常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。 醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）

18、 醇类（常用乙醇） 其它 （丙酮）(1) 醛类 甲醛(福尔马林)应用最广 原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。 优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 注意事项： 缩短固定时间，降低固定温度(4C)，为此组织块不宜过厚。 改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液，减少固定液pH的变化

19、。 固定后充分水洗以减少分子间交联。 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。 戊二醛： 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。 多聚甲醛(常用4%)： 可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。(2) 醇类 最常用的醇类固定剂是乙醇。 其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。 优点：穿透性强、抗原性保存好。 缺点： 脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。 乙醇使蛋白变性的作用轻，

20、固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。(3) 其它固定剂 丙酮： 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。3、抗原修复原因 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得： 抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇； 蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复方法 化学方法 加热方法 水浴加热法 微波照射法 高压加热法 酸水解法(1) 化学方法 主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶

21、等。 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%0.1%，消化时间为37C，1040min，主要用于细胞内抗原的显示； 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%0.4%，消化时间为37C、30180min，主要用于细胞间质抗原的显示。 例如：Laminin、CollagenIV(2) 水浴加热法 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3) 微波照射法 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95以上，持续l015分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运

22、动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。(4) 高压加热法暴露抗原 将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压23min，可取得极好的效果。 由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。(1) 酸水解法 酸水解可使交联断裂、暴露抗原。 将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。 此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项 达到规定的温度(9295C以上)； 维持一定的时间； 避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)； 加热后必须经过室温自然冷却2030分

23、钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型； 修复液： 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液； 最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。4、载玻片的处理 抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。 新载玻片上有油污，要用洗液浸泡1224h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。 常用的粘附剂有： APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷） Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸） 铬明胶溶液APES(3-aminopropyltriethoxysilane)3

24、-氨丙基三乙氧基硅烷 现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v); 将洗净的玻片浸于此液中2030秒钟； 取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60C烤箱烤干。Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸) 将清洁玻片浸于100mg/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37C放置30min，然后60C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。铬明胶溶液 试剂：铬明矾(chrome alum) 0.25g明胶(gelatine) 2.5g蒸馏水500ml 先将铬明矾溶解于40C少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70 C水浴中使明胶溶化，搅拌均

25、匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。 用时稍加溶化，切片浸入23min，过夜晾干。冰冻切片 冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。 在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。 缩短了制片时间 抗原性不受损失 对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。 组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。1、冰冻组织块的常用方法 液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196C)中1020sec； 干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容

26、器，组织投入该容器内结冻则更好； 上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。 制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 C冰箱。2、切片 供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。 载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂； 切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 C 。切片厚度一般为48mm。3、切片后处理 切好的冰冻切片，室温下自然晾干12h后，入4C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20。 冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片

27、的应用受限。组织印片 将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20保存。细胞培养片(细胞爬片) 贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20C固定1020min)，再进行免疫染色。 盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。 为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。细胞涂片 大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括： 血液、尿液、脑脊液； 体腔积液； 组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织 悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。细胞涂片 (续) 细胞涂片的方

28、法： 手涂法 将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。 图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。 涂片机涂片法 将细胞样品制成21056/ml 细胞悬液，吸取50100ml (121045cells) 加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。根据标记物的不同分为免疫荧光法、免疫酶标法、亲和组织化学法。免疫荧光法【原理】 用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原； 免疫荧光技术 荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪； 借助于荧光显微镜进行观察。1、常用的荧

29、光素 (1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC) (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC) (3) 四乙基罗丹明 (RB200) (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)(1) 异硫氰酸荧光素(FITC) 易溶于水和乙醇。 最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为 520530nm呈翠绿色荧光，分子量 389.4。 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记152

30、0个FITC分子。(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC) 最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。 与蛋白质结合的方式同FITC。(3) 四乙基罗丹明(RB200) 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。 RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸e-氨基反应而标记在蛋白分子上。(4) 碘化丙啶(PI) 是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。 PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基

31、无特异性选择。 最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。2、荧光抗体的保存 一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。 一般认为04C可保存12年，-20C可保存34年。 要小量分装，防止反复冻融。 保存前需加防腐剂 (浓度为1:500010000的硫柳汞或1:10005000叠氮化钠) 。3、免疫荧光的染色方法 免疫荧光染色法常用的有 直接法 间接法j原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。k直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (

32、含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min 3/次； 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min 3/次； 2%BSA或10%BSA37C湿盒内封闭30min 抗体染色： 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37C孵育30min；k直接免疫荧光法的操作步骤(续) 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 缓冲甘油封片 分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 镜检：在荧光显微镜下观察。 优点：方法

33、简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。m直接免疫荧光法的注意事项 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； 一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。m直接免疫荧光法的注意事项 (续) 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； 染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； 染色温度：多采用室温(25C)，高于37C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C的低温，延长染色时间。 低温染色过夜较3

34、7 C 30 min效果好的多。m直接免疫荧光法的注意事项 (续) 试验时需设置下列对照： 自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。m直接免疫荧光法的注意事项 (续) 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； 经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。(2) 间接法又称为荧光抗-抗体法j

35、需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。k间接免疫荧光法操作步骤 标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； 一抗染色： 加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37C作用30min或4C过夜。 0.01M PBST漂洗5min3次(震荡漂洗)；k间接免疫荧光法操作步骤(续) 加荧光标记的二抗抗体，37C湿盒避光作用30min。 0.01M PBST避光漂洗5min3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； 甘油缓冲液封片 镜检 优点

36、：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗； 缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。m间接免疫荧光法的注意事项 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。 每次试验时 ，需设置以下三种对照： 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物m间接免疫荧光法的注意事项(续) 标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。 一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。免疫酶酶标法【原理】 以酶作为标记物与外加底物作用后产生

37、不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位； 酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。1、常用的标记酶及其显色底物 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物(1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物 HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好； 底物为过氧化物和供氢体(DH2) 过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。 供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是DAB。DA

38、B (二氨基联苯胺) DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。 目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。(2) 碱性磷酸酶(AP)及底物 AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色： 偶氮偶联反应，底物为a-萘酚磷酸盐，经水解后得a-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。 靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。2、常用的

39、免疫酶染色方法 又分为以下两种方法： 酶标抗体法 直接法 间接法 非标记抗体酶法 酶桥法 PAP法(1) 酶标抗体法 通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。 优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。 缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。(1) 酶标抗体法直接法 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。(1) 酶标抗体法间接法 将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗

40、体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。酶标抗体间接法的操作步骤 标本准备： 石蜡脱蜡至水； 冰冻切片浸入4C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min3； 细胞爬片先用PBS洗，然后4C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min3； 石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续) 封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室温孵育510min (湿盒内) ； 0.01M PBST漂洗，5min3； 510%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭，室温孵育30

41、min (湿盒内) ； 倾去血清勿洗，加1%BSA(PBST配制)稀释的一抗， 37C孵育60min 或4C过夜(湿盒内)；(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续) 0.01M PBST漂洗，5min3； 加HRP标记的二抗室温孵育lh或37C 30min ； 加0.01%H2O20.05%DAB显色 (显色液应新鲜配置)； 经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。(2) 非标记抗体酶法酶桥法 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体； 以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上； 再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布 优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过

42、免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。几点说明 一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。 二抗桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。 因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。(2) 非标记抗体酶法PAP法 与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替; PAP是离体制备的复合物(HRP-抗HRP)。 显

43、色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。PAP法评价 PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。 缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。 由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。亲和组织化学法 是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。 这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。生物素抗生物素染色法【原理】 生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67

44、000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。 该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。(1)标记抗生物素生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB)：分为直接法和间接法。 直接法用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应。 间接法用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一抗体相连结，最后进行呈色反应。(2)桥抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRAB) 此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。(3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法(ABC法) ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。 ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。 分为直接法和间接法。 直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合； 间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。ABC法的评价 敏感性强：ABC